VALUTAZIONE DELL OLIO DI CHIODI DI GAROFANO NEI CONFRONTI DI MELOIDOGYNE INCOGNITA

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1 ATTI Giornate Fitopatologiche, 2012, 1, VALUTAZIONE DELL OLIO DI CHIODI DI GAROFANO NEI CONFRONTI DI MELOIDOGYNE INCOGNITA B. CARLETTI 1, L. SCEVOLA 2, F. PACI 2 1 C.R.A. Istituto Sperimentale per la Zoologia Agraria Via di lanciola 12/A, Firenze 2 Xeda Italia S.r.l. Via Filippo Guarini, 13/A, Forlì (FC) fabio@xeda.it RIASSUNTO Al fine di valutare l efficacia nel contenimento del nematode galligeno Meloidogyne incognita (Kofoid et White) è stata condotta una prova sperimentale in vitro e una in serra utilizzando l olio di chiodi di garofano e un nuovo formulato concentrato emulsionabile (ABT-EU04). Sono state valutate tre concentrazioni dell olio (0,125%, 0,25% e 0,50%) in soluzione acquosa, su uova insegmentate ed embrionate, larve di II stadio libere e incluse negli ovisacchi di M. incognita. L olio di chiodi di garofano ha mostrato un efficacia anche alla più bassa concentrazione utilizzata, inibendo l embriogenesi delle uova e avendo una totale azione nematocida contro larve libere e incluse negli ovisacchi. La prova condotta in serra con la formulazione ABT-EU04 ha confermato i risultati ottenuti in vitro, mostrando una drastica riduzione della densità di popolazione dei nematodi presenti nelle piante di pomodoro, e del numero degli individui vivi e delle uova in vaso. Parole chiave: olio di chiodi di garofano, nematode galligeno, uova, larve, ovisacchi SUMMARY EVALUATION OF A CLOVE OIL EXTRACT AGAINST MELOIDOGYNE INCOGNITA The results of a tests carried out in vitro and in pots experiment to verify the action of clove oil extract and of a new emulsified concentrate formulation ABT-EU04 against Meloidogyne incognita (Kofoid et White) have been reported. Three aqueous concentrations of the clove oil extract (0.125%, 0.25% and 0.50%) have been tested on unsegmented and embryonated eggs, second stage juveniles free and included into the eggmasses of M. incognita. The clove oil is resulted effective also at the lowest concentration, inhibiting the embryogenesis of eggs and showing a total nematocide action against the juveniles free and included into the eggmasses. In the pot experiment, the ABT-EU04 formulation confirmed the in vitro results, it was very effictive in the reduction of nematode infestation in tomato plants, significantly suppressing the total number of live nematodes and eggs on pot. Keywords: clove oil, root-knot nematode, eggs, juveniles, eggmasses INTRODUZIONE Tra gli oli essenziali d interesse fitoiatrico, l olio di chiodi di garofano è da tempo oggetto di investigazione sperimentale per l attività contro nematodi tellurici fitoparassiti. Ottenuto da germogli, foglie e/o fiori della pianta Syzygium aromaticum (L.) Merrill et Perry (= Eugenia caryophyllata Thunb.), l olio di chiodi di garofano ha mostrato un evidente attività contro Anguina tritici (Steinbuch) Filipjev, Tylenchulus semipenetrans Cobb, Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood, M. incognita (Kofoid et White) Chitwood, Heterodera avenae Wollenweber, H. cajani Koshy, H. zeae Koshy, Swarup et Sethi (Chatterjee et al., 1982; Sangwan et al., 1990; Gokte et al., 1991; Leela e Ramana, 2000; Meyer et al., 2008). La recente inclusione dell olio di chiodi di garofano nell allegato europeo dei principi attivi da parte di Xeda International, ha stimolato l impostazione ed esecuzione del presente lavoro al fine di confermare l attività contro il nematode galligeno M. incognita mediante verifica dei

2 meccanismi coinvolti e del rapporto efficacia/dose di applicazione. Inoltre, è stata avviata una prima indagine in vaso sulla formulazione stabilizzata, al 18% di olio di chiodi di garofano (siglato ABT-EU04), messa a punto ed ottenuta nell officina di produzione francese. MATERIALI E METODI Prove in vitro in cella Le prove sono state condotte in vitro utilizzando particolari salierine di vetro concave, con copertura a tenuta per evitare l evaporazione delle soluzioni introdotte. Il piano sperimentale ha previsto 3 tesi (concentrazioni dell olio 0,125%, 0,25% e 0,50%) più il testimone (soluzione di acqua) con 4 replicazioni. In ciascuna salierina sono stati introdotti 2 cc della soluzione con la concentrazione da saggiare, o di acqua sterile. L incubazione è avvenuta sempre in cella climatizzata, al buio, ad una temperatura costante di 24 C. La popolazione di M. incognita proveniva da piante allevate in serra climatizzata di pomodoro var. Marmande. Uova insegmentate ed embrionate: le uova sono state raccolte manualmente da ovisacchi isolati da radici di pomodoro infestate dal galligeno e poste in ciascuna salierina in un minimo volume di acqua (10 µl). L osservazione e i conteggi delle larve schiuse, dalle uova insegmentate o da quelle embrionate, sono stati effettuati rispettivamente per 22 giorni (con controllo ogni 2 giorni) e per 13 giorni (con controllo giornaliero). Sono state utilizzate in media per tesi per salierina da un minimo di 102 a un massimo di 106 uova insegmentate e da un minimo di 130 a un massimo di 156 uova embrionate. Larve di II stadio libere: gli ovisacchi opportunamente isolati dalle radici infestate sono stati messi su un filtro di carta-lana immerso in acqua al fine di raccogliere solo gli individui vitali. In ciascun dispositivo è stata posta una sospensione di larve in un volume minimo di acqua (10 µl). Le osservazioni in questo caso riguardavano la motilità delle larve infestanti immerse nelle varie soluzioni di acqua e del prodotto. I rilievi relativi al numero di larve mobili sono stati fatti quotidianamente per 12 giorni. A 2 e 4 giorni dall inizio della prova un certo numero di larve immerse nelle soluzioni trattate che apparivano immobili sono state trasferite in acqua per capire se le diverse concentrazioni del prodotto avessero un azione nematostatica e/o nematocida. Il numero di larve utilizzate in questa prova è variato in media per tesi per salierina da un minimo di 98 ad un massimo di 101. Larve di II stadio incluse negli ovisacchi: 5 ovisacchi di dimensioni pressoché omogenee e della stessa età sono stati isolati dalle radici infestate e posti in 10 µl di acqua sterile per salierina per un totale di 100 ovisacchi (5 x 4 x 5). Osservazioni e conteggi sul numero di larve schiuse dai medesimi sono stati fatti ogni 2 giorni per 22 giorni, eliminando sempre le larve schiuse. Al 22 giorno sono stati effettuati i conteggi relativi al numero di uova e larve rimaste ancora all interno degli ovisacchi. Questo per poter calcolare, con l aggiunta delle larve già schiuse, il loro contenuto originale. In tale conteggio sono state tenute separate uova, larve morte e larve vive ed è stato osservato se il loro aspetto presentava o meno alterazioni di alcun genere. Dai conteggi effettuati a fine prova è stato evidenziato che in media nei 5 ovisacchi impiegati per ciascuna tesi il contenuto in uova e larve variava da un minimo di 847 a un massimo di Prove in vaso in serra La sperimentazione è stata condotta in serra riscaldata a 25 ± 4 C, secondo uno schema a blocchi randomizzati con 10 repliche, in vasi di 4 litri. E stato utilizzato terreno sabbioso sterilizzato a vapore poi inoculato artificialmente, con uova per vaso di M. incognita, al trapianto delle piantine di pomodoro tipo San Marzano. I trattamenti sono stati effettuati a 7 e 15 giorni dopo il trapianto somministrando la formulazione stabilizzata al 18% di olio di 484

3 chiodi di garofano (siglato ABT-EU04) alle seguenti dosi: 0,347% (pari a 0,0625% di olio), 0,694% (pari a 0,125%), 1,389% (pari a 0,250%). Dopo tre mesi dal trapianto si è proceduto alla valutazione del grado di infestazione del nematode sulle radici, secondo la scala di valutazione da 0 a 5 dell indice medio di infestazione delle radici (IMI), alla determinazione del numero di uova e larve per grammo di radice (Hussey e Barker, 1973), alla densità totale di popolazione nel terreno (Coolen, 1979) e al relativo incremento (Pf/Pi, popolazione finale/popolazione iniziale). I dati raccolti nei diversi rilievi sono stati elaborati tramite analisi della varianza e le medie confrontate con il test di Duncan (p=0,05). RISULTATI E DISCUSSIONE Prove in vitro in cella Uova insegmentate (tabella 1). Durante i primi due giorni di osservazione non si è avuta alcuna schiusura di larve di II stadio; nei giorni successivi la percentuale di larve schiuse è aumentata gradualmente nel testimone fino ad arrivare a un valore medio di 76,7% al 20 giorno. Nella tesi 1, che prevedeva una soluzione allo 0,125% di prodotto, dopo 4 giorni lo 1,0% appena di larve erano schiuse, valore che si è mantenuto invariato fino all ultimo giorno. Nelle tesi 2 e 3, con soluzioni a concentrazioni superiori e precisamente allo 0,3% e allo 0,5%, non si è avuta alcuna schiusura dalle uova per tutto il tempo in cui si è svolto l esperimento. Tabella 1. Azione di diverse concentrazioni di estratto di chiodi di garofano sulla schiusura di uova insegmentate di M. incognita: percentuale di larve schiuse (media di 4 repliche) Form. 2 gg 4 gg 6 gg 8 gg 10 gg 12 gg 14 gg 16 gg 18 gg 20 gg Test ,2 12,6 20,2 33,7 45,5 58,2 74,3 75,9 76,7 1 0,l25% ,25% ,50% Tabella 2. Azione di diverse concentrazioni di estratto di chiodi di garofano sulla schiusura di uova embrionate di M. incognita: percentuale di larve schiuse (media di 4 repliche) form. 1 gg 3 gg 5 gg 7 gg 9 gg 11 gg 13 gg Test. - 14,7 30,9 43,3 51,6 65,7 77,5 78,1 1 0,125% 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 2 0,25% 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 3 0,50% Uova embrionate (tabella 2). Fin dal 1 giorno si è avuta una emergenza di larve dalle uova embrionate in tutte le tesi, maggiore nel testimone dove è stata in media pari al 14,7%, nelle altre tre tesi è variata da un minimo di 0,8% a un massimo di 2,4%. Però, mentre nel testimone l emergenza è aumentata gradualmente protraendosi fino al 13 giorno, raggiungendo un valore medio pari al 78,1%, nelle altre tesi la schiusura si è interrotta dopo il 1 giorno. Larve di II stadio libere (tabella 3). Fin dal 1 giorno si è osservato che nelle 3 tesi sperimentali le larve apparivano già tutte immobili, mentre nel testimone le larve perdevano la loro motilità in maniera molto graduale. Al 12 giorno in media l 82,2% di larve risultava ancora attiva. 485

4 Tabella 3. Azione di diverse concentrazioni di estratto di chiodi di garofano sulla motilità di larve di II stadio di M. incognita: percentuale di larve mobili (media di 4 repliche) form. 1 gg 2 gg 3 gg 4 gg 6 gg 8 gg 10 gg 12 gg Test. - 97,2 95,5 93,8 93,5 93,0 89,2 84,0 82,2 1 0,125% ,25% ,50% Tabella 4. Azione di diverse concentrazioni di estratto di chiodi di garofano sulla schiusura di larve di II stadio da ovisacchi di M. incognita: percentuale di larve schiuse (media di 4 repliche) form. 2 gg 4 gg 6 gg 8 gg 10 gg 14 gg 18 gg 22 gg Test. - 12,3 24,1 28,5 37,9 45,5 51,5 55,3 57,2 1 0,l25% 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 2 0,25% 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 3 0,50% 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Tabella 5. Percentuale di uova e di larve di II stadio di M. incognita contenute all interno degli ovisacchi (media di 4 repliche) form. Larve schiuse Uova e larve rimaste all interno degli ovisacchi uova larve vive larve morte Test. - 57,2 41,1 0 1,7 1 0,l25% 0,4 99, ,25% 0,1 99, ,50% 0,3 99,7 0 0 La prova condotta trasferendo in acqua un certo numero di larve in apparenza immobili, immerse nelle tre concentrazioni di olio di chiodi di garofano, ha evidenziato l azione nematocida del prodotto, che si è manifestata già alle concentrazioni più basse. Infatti nessuna larva ha mai ripreso la propria motilità. Le larve trattate apparivano estremamente vacuolizzate al loro interno. Larve di II stadio incluse negli ovisacchi (tabelle 4, 5) Dai dati rilevati durante i 22 giorni in cui si è svolta la prova è apparso evidente che dagli ovisacchi immersi nella sola acqua già al 1 giorno è emerso in media il 12,3% di larve, questo valore è aumentato gradualmente fino quasi alla fine della prova, raggiungendo in media il 57,2% del contenuto totale degli ovisacchi. Dagli ovisacchi immersi nelle diverse concentrazioni di olio di chiodi di garofano, la schiusa si è bloccata già al 1 giorno con un valore in percentuale non significativo compreso tra 0,1 e 0,4%. 486

5 Dal conteggio effettuato a fine prova (tabella 5) per valutare il numero di uova e larve vive o morte rimaste all interno degli ovisacchi, si è constatato che nel testimone in media il 41,1% era rappresentato essenzialmente da uova ancora insegmentate e solo dall 1,7 % da larve morte. Nelle tesi 1, 2 e 3 all interno degli ovisacchi era rimasta ancora la totalità di uova essenzialmente insegmentate. Non c era alcuna traccia di larve schiuse. Le uova insegmentate apparivano al loro interno come disintegrate e in quelle embrionate non si riusciva a riconoscere la forma della larva. In tutte le prove in vitro, l estrema efficacia del prodotto oggetto d indagine ha reso inutile l elaborazione statistica e la rappresentazione dei risultati tramite i grafici. Prove in vaso in serra L applicazione del siglato ABT-EU04 ha ridotto significativamente la presenza di galle sulle radici a tutte le concentrazioni saggiate con esiti tendenzialmente migliori a dosaggi più elevati. Ciò è confermato anche dalla riduzione rispetto al non trattato del numero di uova e larve nelle radici, osservata in tutte le tesi ma statisticamente differente dal testimone alla concentrazione di 1,389%. Un azione ben più incisiva è stata rilevata sulla carica di nematodi nel terreno, a dimostrazione dell attività nematocida dell olio di chiodi di garofano sulle forme libere nel terreno. Il conteggio del numero di uova e larve nel terreno ha mostrato chiaramente una drastica riduzione nelle tesi trattate rispetto al testimone, cosi come è risultato significativo il minore incremento di popolazione (Pf/Pi). Anche in questi rilievi, la dose di 1,389% del siglato ABT-EU04 ha garantito un attività costantemente più performante. Tabella 6. Prova in vaso: effetto dei trattamenti nei confronti di M. incognita formulato IMI (0-5) Uova + larve/g di radice Uova + larve/cm 3 di terreno Pf/Pi Testimone non trattato - 4,7 a a 570 a 228 a ABT-EU04 0,347% 2,5 b ab 89,7 b 35,9 b ABT-EU04 0,694% 2,1 b ab 86,4 b 34,6 b ABT-EU04 1,389% 1,7 bc b 75,5 bc 30,2 bc I dati seguiti dalla stessa lettera, nella stessa colonna, non differiscono al test di Duncan (p = 0,05) Formulato utilizzato: ABT-EU04 concentrato emulsionabile al 18% di olio di chiodi di garofano CONCLUSIONI Da quanto esposto è possibile affermare che l olio di chiodi di garofano ha manifestato in vitro una spiccata attività nematocida nei confronti di M. incognita. Precisamente la sua azione si è espletata nel blocco dello sviluppo embrionale dell uovo unicellulare e nel blocco della schiusura della larva di II stadio dall uovo che già la contiene, impedendo inoltre sia lo sviluppo delle uova che la schiusura delle larve di II stadio contenute negli ovisacchi. Dai risultati delle prove effettuate è emerso altrettanto chiaramente l azione nematocida nei confronti delle larve libere di II stadio. E importante sottolineare che queste attività si sono manifestate subito, non appena i vari stadi di sviluppo del nematode sono venuti a contatto con il prodotto, indipendentemente dalla concentrazione impiegata. Tali indicazioni ottenute in laboratorio sono state confermate anche nelle applicazioni su vaso in serra, dove la formulazione ABT-EU04 ha contenuto in maniera significativa la popolazione del nematode 487

6 riducendo drasticamente il numero di uova e larve libere nel terreno. Sono in corso verifiche sperimentali su colture orticole in serra e pieno campo al fine di confermare i promettenti risultati ottenuti nel presente contributo e rendere concretamente l olio di chiodi di garofano un valido strumento nel sempre più problematico contenimento delle popolazioni dei nematodi galligeni. LAVORI CITATI Coolen W.A., Methods for the extraction of Meloidogyne spp. and other nematodes from roots and soil. In: Root-knot nematodes (Meloidogyne species). Systematic, Biology and control (Lamberti F. e Taylor) C.E. eds, Chatterjee A., Sukul N.C., Laskar S. and Ghoshmajumdar S., Nematicidal principles from two species of Lamiaceae. J. Nematol 14, Gokte N., Maheshwari M.L. and Mathur V.K., Nematicidal activity of new essential oils against root-knot and cyst nematode species. Indian J. Nematol., 21, Hussey R.S., Barker K.S., A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Dis. Reptr., 45, Leela N.K. and Ramana K.V., Nematicidal activity of the essential oil of allspice (Pimenta dioica (L.) Merr.). J. Plant. Biol., 27, Meyer Susan L.F., Lakshman Dilip K., Zasada Inga A., Vinyard Bryan T. and Chitwood David J., response effects of clove oil from Syzygium aromaticum on the rootknot nematode Meloidogyne incognita. Pest. Manag. Sci., 64, Sangwan N.K., Verma B.S., Verma K.K. and Dhindsa K.S., Nematicidal activity of some essential plant oils. Pestic. Sci. 28,