Introduzione. Fig.1: Ciclo di assimilazione del nitrato (NO 3 - ) Nitrato riduttasi

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1 SAGGIO DI ATTIVITÀ DELLA NITRATO RIDUTTASI IN ESTRATTI FOGLIARI Introduzione L'azoto nelle sue diverse forme rappresenta l'elemento maggiormente richiesto dalle piante per la crescita. La disponibilità nel suolo di questo elemento dipende da fattori abiotici e biotici, come l'erosione, la lisciviazione e l'attività microbica. Le piante hanno sviluppato diversi meccanismi per poter utilizzare l'azoto presente nel terreno in limitate concentrazioni. La maggior parte delle piante riesce ad utilizzare l azoto sotto forma inorganica come nitrato e ammoniaca o sotto forma organica come urea o aminoacidi; alcune piante inoltre possono assimilare l'azoto atmosferico instaurando delle simbiosi con batteri. La risposta ad una particolare forma di una azoto è tuttavia diversa da specie a specie. La più abbondante fonte di azoto per le piante che non formano associazioni con microrganismi azotofissatori è costituita dai nitrati. Fig.1: Ciclo di assimilazione del nitrato (NO 3 - ) Come si può osservare in Fig. 1 il primo passaggio nella acquisizione di azoto (come nitrato) consiste nell'assorbimento dell NO 3 - attraverso la membrana plasmatica delle cellule epidermiche e corticali della radice. La concentrazione dei nitrati nei suoli non coltivati è sempre piuttosto bassa ( M) con forti variazioni stagionali e spaziali. Nei suoli coltivati i valori sono naturalmente assai più alti (in media 5 10 mm). Il trasporto del nitrato attraverso la membrana plasmatica avviene mediante un gradiente elettrochimico generato da una pompa ATP-asica; per ogni ione nitrato vengono trasportati all'interno della cellula due protoni. Successivamente lo ione nitrato può essere trasportato attraverso il tonoplasto ed immagazzinato nel vacuolo, oppure può essere organicato, nelle cellule della radice o, a seguito del trasportato con la linfa xilematica, nelle foglie. Il nitrato non può essere assimilato come tale ma deve essere prima convertito in NH + 4. La riduzione del nitrato è un processo a due stadi: l NO 3 viene prima ridotto a nitrito dall'azione della nitrato riduttasi (NR). Il nitrito quindi passa nel plastidio dove tramite la nitrito riduttasi (NIR) si riduce ad ammoniaca. L ammoniaca è tossica in quanto agisce da disaccoppiante nel cloroplasto e quindi viene rapidamente convertita in glutammina e glutammato. La riduzione del nitrato e l assimilazione dell ammonio sono processi molto regolati. Sia nei funghi che nelle piante la somministrazione di nitrato induce l'espressione dei geni per la sintesi dei trasportatori dei nitrati, della nitrato riduttasi, della nitrito riduttasi e della glutammina sintetasi. Nelle piante l'induzione si verifica in pochi minuti e in risposta a concentrazioni di nitrato molto basse (inferiori a 10 M). L enzima che appare sottoposto alla regolazione più complessa e anche quella più conosciuta è la nitrato riduttasi (NR). Nitrato riduttasi La NR è localizzata nel citosol delle cellule corticali ed epidermiche della radice e nelle cellule del mesofillo del germoglio. L enzima è formato da due subunità identiche ognuna con tre gruppi prostetici: FAD,

2 2 un eme ed un complesso di molibdeno con una molecola organica la pterina (MoCo). La NR trasferisce due elettroni dal NAD(P)H al nitrato con formazione del nitrito. NR con tre gruppi prostetici Complesso Mo-pterina Determinazione dell attività della NR in foglie di spinacio o bietola Lo scopo dell esercitazione è la determinazione spettrofotometrica mediante il reagente di Griess dell attività della NR in estratti fogliari di spinacio o bietola. Viene aggiunto NO 3 agli estratti e si quantifica l NO 2 prodotto dalla NR. Il nitrito forma con il reagente di Griess un azocomposto che ha massimo assorbimento a 540 nm (colore rosa più o meno intenso). Una maggiore assorbanza indicherà maggiore presenza di nitrito prodotto e quindi maggiore attività NR. Reagenti (NB: i reagenti devono essere freddi) Tampone di estrazione (Hepes 50 mm ph MgCl 2 5mM + EDTA 1 mm + Glicerolo 11.5% + Triton X %) Attività NR NO NAD(P)H + H + NO NAD(P) + + H 2 O La trascrizione (risposta a lungo termine da ore a giorni) e l attività (modulazione posttraduzionale: rapidi cambiamenti dell attività- da minuti a ore) della NR sono regolati da molti fattori (Fig. 3): nitrato: trascrizione; luce: trascrizione e attività; livello di CO 2 : attività; carboidrati (saccarosio): trascrizione; ritmi circadiani: trascrizione; L attività della NR è controllata nel breve periodo da meccanismi reversibili di inattivazione/attivazione della proteina. In assenza, o carenza di luce o in un ambiente con bassa concentrazione di CO 2, l'attività della NR decresce rapidamente da 3 a 10 volte. La regolazione rapida e reversibile dell attività della NR comporta una modifica covalente della proteina e si basa su un meccanismo di fosforilazione (Enzima inattivo) e defosforilazione (Enzima attivo) di uno specifico residuo di serina. Hepes 250 mm ph 7.5 KNO mm NADH 2 mm NaNO mm (0.1 nmoli/) Sulfanilammide all'1% in HCl 3 N (SULF) N-naftil etilenediamina diidrocloruro allo 0.02% (NEDD). SULF + NEDD = Reagente di Griess (1:1) Materiali Foglie fresche di spinacio o bietola Sabbia di quarzo Cilindri da 10 ml Mortai con pestelli e vetreria (in contenitori con ghiaccio) Pipette di plastica (o vetro) Vial con tappo per raccogliere l estratto Eppendorf da 2 ml Portaprovette per Eppendorf Centrifuga da banco per Eppendorf Pipette automatiche con puntali Bagnomaria a 30 C H 2 O

3 3 A) ESTRAZIONE DELL ENZIMA Pesare 0.5 g di foglie fresche di spinacio o bietola e porli in un mortaio raffreddato con ghiaccio. Aggiungere una punta di spatola di sabbia di quarzo e 3.5 ml di tampone di estrazione. Macinare, mantenendo il mortaio in ghiaccio, fino ad ottenere un omogenato. Trasferire l omogenato in 2 eppendorf da 2 ml, e centrifugare per 5-10 min a g. Raccogliere i surnatanti, che contengono l enzima NR, e riunirli in una provetta in vetro che sarà tenuta in ghiaccio fino alla fine dell esperimento. B) REAZIONE ENZIMATICA Mettere 6 eppendorf da 2 ml in un apposito portaprovette. In tutte le eppendorf, aggiungere i seguenti reagenti: 100 Hepes 250 mm ph KNO mm + 50 NADH 2 mm Poi aggiungere l estratto enzimatico e l acqua ( fino ad ottenere un volume finale di 0.5 ml) come indicato nella seguente tabella. Chiudere le eppendorf, agitare lievemente e porle in un bagnetto a 30 C per 15 minuti (reazione). Fermare la reazione trasferendo le eppendorf in ghiaccio (fino all aggiunta del Reagente di Griess). Eppendorf Estratto (NR) H 2 O Reagente di Griess Volume finale ml A ml ( ) 1.3 Ab (bianco) ml ( ) 1.3 B ml ( ) 1.3 Bb (bianco) ml ( ) 1.3 C ml ( ) 1.3 Cb (bianco) ml ( ) 1.3 C) CURVA DI TARATURA E DETERMINAZIONE DEL NITRITO PRODOTTO La determinazione colorimetrica della concentrazione di nitrito prodotto dalla NR viene fatta usando una curva di taratura standard, la quale si ottiene misurando l assorbanza di soluzioni di NaNO mm in quantità crescenti (0 20 nmoli di NO 2 ). La reazione colorimetrica avviene tramite l aggiunta di un colorante (reagente di Griess), composto da SULF + NEDD (1:1). Mettere 5 eppendorf da 2 ml nel portaprovette. Aggiungere con una pipetta automatica le quantità crescenti della soluzione stock di NaNO mm (vedi tabella seguente). Aggiungere H 2 O fino a un volume di 0.5 ml.

4 4 Curva di taratura Eppendorf n NO 2 nmoli Stock NaNO 2 H 2 O Reagente di Griess ml Volume finale ml ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 1.5 D) REAZIONE COLORIMETRICA SULL ESTRATTO E SULLA CURVA DI TARATURA Aggiungere 500 di SULF alle eppendorf della curva di taratura e alle eppendorf con l estratto enzimatico. Aggiungere subito dopo 500 di NEDD. Chiudere bene tutte le eppendorf, agitare, e lasciare reagire per 15 min a temperatura ambiente. Leggere allo spettrofotometro l assorbanza a 540 nm (Abs 540 ) degli estratti enzimatici e della curva di taratura, usando come blank una cuvetta vuota. Riportare le letture nella seguente tabella: Estratto Abs 540 Curva di taratura Abs 540 enzimatico A 1 Ab 2 B 3 Bb 4 C 5 Cb Costruire una curva di taratura per il nitrito (Fig. 2) e calcolare la quantità di nitrito prodotta dalla reazione nelle provette A, B e C dopo avervi eventualmente sottratto l assorbanza rispettivamente delle provette Ab, Bb e Cb in cui il colore è dovuto solamente ai pigmenti e non alla sintesi di nitrito. N.B.: Se l assorbanza del bianco ha un valore positivo, andrà sottratto dal valore di lettura del corrispondente campione.

5 Confrontando i valori con quelli della curva di taratura, risalire alla quantità di nitrito formato, trasformarla in picomoli (1 pmol=0.001 nmol), ed esprimere l attività NR come pkat (pkat = pmoli di NO 2 prodotto/sec). Il katal (kat) è l unità di misura internazionale per l attività catalitica (o enzimatica); 1 kat=1 mol/sec. Il tempo di reazione (15 min) espresso in secondi = Esempio di calcolo: Abs 540 estratto (50 ) = 0.16, corrispondenti in base alla curva di taratura a 4.89 nmoli NO = 4890 pmoli NO pmoli NO 2 : 900 sec.= 5.43 pkat Assorbanza Nitrito (nmoli) Fig. 2: Curva di taratura

6 6 (Lillo C et al. J. Exp. Bot. 55, , 2004) Regolazione attività enzimatica: rapidi cambiamenti (da minuti a ore) - Luce: induce la de fosforilazione e NR si attiva; - Buio: NR è fosforilata (NR-P) lega le proteine e si inattiva; - Livelli di CO 2 : l attività della NR decresce (da 3 a 10 volte) a bassi livelli Il bilancio tra attività chinasica e fosfatasica determina lo stato di fosforilazione dell enzima. NR è degradata ad un tasso costante sia alla luce che al buio. Proteine : proteine regolatrici che si legano a diverse proteine enzimatiche (es chinasi, fosfatasi, ecc) e recettori. Regolazione trascrizione: lungo termine (da ore a giorni) Nitrato, luce, saccarosio, ritmo circadiano Fig. 3: Schema di regolazione della nitrato riduttasi

7 7 DOMANDE 1. Il saggio fornisce una misura dell attività della NR in presenza di una quantità saturante di substrato. Quale informazione avreste ottenuto misurando l attività della NR omettendo il nitrato dalla miscela di reazione? 2. In termini di attività NR, cosa comporta la comparsa di una colorazione più o meno intensa dopo l aggiunta dei reagenti di Griess? 3. Perché viene aggiunto NADH 2mM per effettuare la reazione per la determinazione colorimetrica dei nitrati? 4. La riduzione del nitrato a nitrito nella cellula vegetale è un processo molto regolato. Quali sono i fattori che controllano l attività della NR?