DETERMINAZIONE DELL ACIDO ASCORBICO IN TESSUTI VEGETALI ***********************

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Giordano Mazza
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1 DETERMINAZIONE DELL ACIDO ASCORBICO IN TESSUTI VEGETALI *********************** L acido ascorbico (o vitamina C) è uno delle proteine e del DNA. Questa serie di zucchero acido a 6 atomi di C (C 6 H 8 O 6 ) e la reazioni nelle cellule sono prevenute più abbondante molecola antiossidante dall azione di enzimi antiossidanti (es. solubile in acqua delle piante e degli animali. superossido dismutasi-sod, ascorbato Nelle piante sembrano essere attive diverse perossidasi-apx, glutatione reduttasi, vie di sintesi dell ASC, anche se dati sperimentali recenti hanno dimostrato che la via principale è quella detta Smirnoff- Wheeler pathway chiamata anche via del L- glutatione perossidasi,catalasi) e di sostanze donatrici di elettroni. Gli enzimi antiossidanti catalizzano reazioni redox, in molte delle quali utilizzano elettroni ceduti da galattosio (precursore diretto dell ASC). sostanze generalmente chiamate antiossidanti Nelle cellule vegetali i radicali liberi a basso peso molecolare come acido dell ossigeno (radicali: atomi o molecole con un numero dispari di elettroni; es., ione superossido O - 2, ione idrossilico OH - ), e altre forme reattive dell O 2 (es. H 2 O 2 e l ossigeno singoletto - 1 O 2 ) sono prodotti durante i ascorbico (ASC) e glutatione (tripeptide), oltre a tocoferoli (vitamina E), flavonoidi e carotenoidi. Una efficace distruzione di O - 2 e di H 2 O 2 richiede l azione simultanea di enzimi antiossidanti come ad esempio la SOD normali processi metabolici (es. durante il - (trasforma O 2 in H 2 O 2 ) e APX (trasforma trasporto di elettroni nella respirazione e H 2 O 2 in H 2 O). Il substrato riducente per l fotosintesi). Tutte le specie reattive H 2 O 2 è l ASC con formazione di acido dell ossigeno sono dette ROS (reactive deidroascorbico (ADA). Gli atomi di H dei oxygen species). La pericolosità dei ROS e in particolare di O - 2, H 2 O 2, e OH - è dovuta alla loro capacità di iniziare una serie di reazioni a due gruppi enolici dell ASC possono essere facilmente ossidati rendendo l ASC un forte agente riducente (Figura 1). catena che portano all ossidazione dei lipidi, Figura 1 Acido ascorbico Acido monodeidroascorbico Acido deidroascorbico

2 Nei cloroplasti, che contengono alte concentrazioni di ASC, può anche avvenire la riduzione diretta di O - 2 ad opera dell ASC. Tutte le piante e gli animali, eccetto i primati (le scimmie e l uomo), sintetizzano l ASC. L ASC si accumula in tutti i tipi di tessuti vegetali, fino a concentrazioni millimolari (plastidio e citosol mm). Le foglie molto spesso contengono più ASC che clorofilla, il pool di ASC può rappresentare circa il 10 % dei carboidrati solubili. Nelle piante l ASC ha un ruolo fondamentale nella protezione della clorofilla e di alcune attività enzimatiche che hanno uno ione metallico come gruppo prostetico. Anche nell uomo i ROS sono prodotti durante il normale metabolismo. L ambiente esterno (es. fumo, aria inquinata, radiazioni. ecc) è un altra fonte di ROS. Queste specie attive dell ossigeno provocano alterazioni sui lipidi (ossidazione), proteine (alterazioni delle membrane, diminuzione attività enzimatiche) e DNA (mutazioni). Molti stati patologici e processi degenerativi sono correlati all azione dei ROS, in particolare contribuiscono all insorgenza o progressione del cancro, dell invecchiamento, di stati infiammatori, di reazioni a farmaci e tossine, e altre condizioni patologiche che colpiscono il cervello, i globuli rossi, il sistema cardiovascolare, la pelle, il tratto gastrointestinale e l apparato visivo. I meccanismi di difesa dell organismo umano contro i ROS sono alcuni enzimi (Figura 2) e le molecole antiossidanti assunte con la dieta (ASC, vitamina E, carotenoidi e fenoli) (Figura 3). L organismo umano produce alcune molecole antiossidanti: es. glutatione e ubiquinolo ma da sole non sono in grado di contrastare totalmente il danno ossidativo che nel tempo contribuisce all invecchiamento ed all insorgenza di diverse malattie. La prolungata carenza di ASC causa lo scorbuto, una grave affezione che colpisce le mucose e provoca emorragie. Nell uomo l ASC è coinvolto anche in altri processi metabolici come: la sintesi della carnitina (molecola essenziale per il metabolismo dei lipidi), l assorbimento del ferro, la conversione dell acido folico nella sua forma attiva THFA (acido tetraidrofolico) e nella sintesi dell adrenalina e della noradrenalina. Questi due neurotrasmettitori vengono elaborati a livello della regione midollare dei surreni e del sistema nervoso; per tale motivo, in questi tessuti si riscontra la più elevata concentrazione corporea di acido ascorbico. Come tutte le vitamine, l ASC non essendo sintetizzato dall organismo umano deve pertanto essere introdotto attraverso gli alimenti. L ASC è presente soprattutto nei prodotti ortofrutticoli. Attualmente la dose consigliata di assunzione è di circa 200 mg al giorno, in un soggetto sano adulto e di corporatura media (dati 1999, in precedenza era di mg al giorno). Questa quantità è contenuta in 5 serving size (corrisponde a 3 frutti + 2 porzioni di

3 3 ortaggi). Il fabbisogno aumenta in caso di dell ASC e, dunque, una minore quantità di malattie acute e in gravidanza. La cottura vitamina disponibile. prolungata dei cibi determina la degradazione ******************************************************************************* Lo scopo di questa esercitazione è quello di determinare: a) la quantità di ASC in tessuti vegetali freschi b) l influenza della bollitura in acqua di un tessuto vegetale sulla concentrazione di ASC. Materiali - 10 g di foglie fresche - bilancia - mortaio e pestello - sabbia - carta bibula - navicelle di plastica - centrifuga - spatole - buretta (10 ml) - beaker - beute - cilindri - tubi da centrifuga (corex) - agitatore ed ancorette - soluzioni:-acido Ascorbico (100 mg / 50 ml = 2 mg / 1ml; tenere al buio e al freddo) -acido metafosforico 5 % (100 ml) -diclorofenolo-indofenolo (DCIP) 40 mg / 50 ml. Come detto in precedenza l ASC è un forte riducente e questa proprietà viene sfruttata per misurare la quantità di ASC presente nei tessuti vegetali. Il DCIP è un colorante di colore blu, in ambiente alcalino, e rosa, in ambiente acido. In presenza di ASC il DCIP è ridotto e la soluzione è incolore. Se una goccia di DCIP blu viene fatta cadere in un estratto acido, la goccia rapidamente diventerà rosa e quindi incolore. Quando tutto l ASC dell estratto è stato convertito in ADA non ci sono più elettroni per ridurre il DCIP e la soluzione rimane rosa (Figura 4). Quindi, assumendo che l ASC sia la sola sostanza antiossidante presente nell estratto che riduce il DCIP, la quantità di ASC può essere calcolata misurando il volume di DCIP necessario per ottenere la soluzione rosa.

4 Figura 4 Titolazione di una soluzione standard di ASC con il DCIP - Preparare le soluzioni di ASC, DCIP e acido metafosforico; - Preparare la seguente soluzione: 1ml della soluzione di ASC (2 mg / 1ml) + 9 ml di acido metafosforico al 5 % ; - Iniziare la titolazione con la soluzione di DCIP fino a quando la soluzione di ASC non rimane rosa per almeno 15 di agitazione; - Leggere sulla buretta il volume di DCIP impiegato nella titolazione; - Questa operazione dovrebbe essere ripetuta almeno 2 o 3 volte - Calcolare la quantità di ASC (mg) equivalente ad 1 ml di DCIP: x mg ASC 2 mg di ASC = ml di DCIP ml di DCIP

5 5 Procedura - Pesare g di foglie; - Mettere 5 g di foglie a bollire in acqua per 5 min; - Mettere gli altri 5 g in un mortaio ed immergere le foglie nel solvente di estrazione (acido metafosforico 5 %) circa ml (la presenza di acido metafosforico previene l attività dell ascorbato ossidasi che potrebbe convertire l ASC in ADA); - Aggiungere la sabbia ed omogeneizzare per alcuni minuti; - Omogeneizzare anche le foglie bollite con lo stesso procedimento; - Filtrare con carta bibula o centrifugare 5 a 4000 rpm (consigliato); - Misurare il volume finale dell estratto fresco e bollito: ml ; - Prelevare 10 ml di estratto ed iniziare la titolazione; - Leggere il volume di DCIP utilizzato per le titolazioni; - Calcolare la quantità di ASC presente in 10 ml di estratto fresco e bollito: mg di ASC mg di ASC in 10 ml = ml di DCIP x ml di DCIP - Calcolare la quantità di ASC in 100 g di tessuto fresco e bollito: mg di ASC Volume totale estratto (ml) = mg di ASC in 10 ml x x g tessuto 10 ml di estratto 5 g (materiale pesato) Domande 1. Quali sono le forme attivate dell ossigeno più pericolose che partecipano ai processi di ossidazione dei lipidi, proteine e DNA? 2. Quale risultato avremmo ottenuto se fosse stato omesso l acido metafosforico dal mezzo di estrazione delle foglie bollite?

6 6 Figura 2 Catalase Figura 3

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