Genomi vegetali. Il DNA nella cellula non è contenuto solo nel nucleo ma anche all interno di: Mitocondri DNA mitocondriale MtDNA

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1 Genomi vegetali Il DNA nella cellula non è contenuto solo nel nucleo ma anche all interno di: Mitocondri DNA mitocondriale MtDNA Plastidi (classificabili in base alla loro colorazione): verdi cloroplasti di altri colori (rossi, arancioni e gialli) cromoplasti incolori leucoplasti

2 mitocondri: struttura 1 membrana esterna presenza di porina (passaggio di molecole < 10 KDa) 2 membrana interna (impermeabile, presenza di trasportatori specifici) 3 spazio intermembrana (risulta più acido dello matrice, gradiente chemio-osmitoco) 4 matrice (matrice acquosa colloidale contenente numerosi enzimi, ribosomi e molecole di DNA mitocondriale (mtdna) Dimensioni: 1-2μm cioè la grandezza media di un batterio Il numero di mitocondri/cellula è correlato con l attività metabolica cellulare

3 .e funzione! Centrale energetica della cellula trasformazione del piruvato in acetilcoa ciclo delll acido citrico (Krebs) catena respiratoria accoppiata alla sintesi di ATP catabolismo degli acidi grassi (β ossidazione) parte del ciclo dell urea deposito di calcio omeostasi del calcio citoplasmatico Complesso I: NADH deidrogenasi Complesso II: succinato deidrogenasi Complesso III: ubichinolo-citocromo c reduttasi Complesso IV: citocromo c ossidasi Complesso V: ATP sintasi

4 DNA mitocondriale mtdna La maggior parte dei genomi mitocondriali sono molecole di DNA circolare, a doppia elica e superavvolte Presenza di diversi nucleoidi all interno della cellula Alcuni mtdna sono lineari (protozoi ciliati, alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii ) Anche per le Angiosperme si ritiene che mtdna sia circolare, tuttavia i genomi mitocondriali vegetali sono fisicamente eterogenei e caratterizzati da una particolare complessità strutturale. mtdna non è associato a istoni o a proteine simili

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6 Dimensioni del mtdna Dimensioni: mtdna animale Kbp, funghi Kbp, piante Kbp

7 Dimensioni dei DNA mitocondriali Organismo Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae Kbp 16, Arabidopsis thaliana 372 Oriyza sativa (riso) 492 Merchantia polyorpha (epatica) Cucumis melo (melone) 187 (minimo) 2400 Non c è correlazione tra le dimensioni dei genomi nucleari e mitocondriali nelle piante: Arabidopsis possiede uno dei genomi nucleari più piccoli, ma il suo genoma mitocondriale è di dimensioni medie

8 Geni identificati in DNA mitocondriali 1 RNA ribosomale Subunità grande Subunità piccola 5S 2 RNA transfer 3 proteine della catena respiratoria ComplessoI Complesso III Complesso IV Complesso V 4 proteine ribosomali 5 biogenesi del citocromo c: geni presenti solo nelle piante

9 Contenuto di geni del mtdna di Chlamydomonas Geni che codificano per proteine Geni di rrna Geni di trna Gene Prodotto genico cob Apocitocromo coxi Subunità I della citocromo ossidasi Nad1, nad2, nad4, nad5, nad6 Subunità della NADH deidrogenasi L1-L8 Segmenti che codificano subunità grandi di rrna S1-S4 Segmenti che codificano subunità piccole di rrna W trna del triptofano Q trna della glutammina M trna della metionina (di allungamento, non di inizio)

10 Complessità fisica e instabilità strutturale del genoma mitocondriale vegetale Profili di restrizione con endonucleasi dell mtdna sono caratterizzati da un elevato numero di frammenti, alcuni dei quali presenti in quantità molto piccole rispetto agli altri Studi di mappaggio e di sequenziamento hanno rivelato sequenze ripetute presenti in poche copie nel genoma Queste sequenze ripetute hanno un importante funzione nel produrre gran parte dell eterogeneità che caratterizza mtdna vegetale

11 Plant mitochondrial genome organization I e II rappresentano le sequenze ripetute

12 One Master Circle or Several Smaller Circles? One master circle? Several smaller circle? sublimons Vs. Multipartite organization! Restricted mtdna

13 La complessità globale dell intero mtdna può essere riassunta all interno di una singola molecola circolare detta cromosoma principale (master circle). All interno del cromosoma principale si possono distinguere le zone ripetute. Le sequenze ripetute: non sono conservate tra le diverse specie possono avere lo stesso orientamento oppure direzione opposta possono generare inversioni possono generare anche molecole sub-genomiche in seguito a delezioni, alcune delle molcole generate sono presenti in quantità molto esigue (sublimoni) determinano infine una struttura genomica multi partita

14 Recombination across inverted repeats leads to inversions

15 Recombination across direct repeats leads to deletions

16 Various Sizes of DNA molecules in Plant Mitochondria mtdna molecules in Chenopodium album

17 Dato che il cromosoma principale e le molecole sub-genomiche circolari sarebbero di notevoli dimensioni, è probabile che non resistano all isolamento in forma integra, e ciò può spiegare l elevata proporzione di molecole lineari eterogenee, rispetto alle circolari, che vengono isolate dall mtdna vegetale. Il modello multipartito spiega l esistenza e i rapporti strutturali di molte sequenze ripetute che sono state identificate negli mtdna mitocondriali, tuttavia apre una serie di quesiti: come si replica il DNA mitocondriale vegetale? come segrega durante la divisione cellulare?

18 Geni del DNA mitocondriale delle Angiosperme RNA ribosomali e relativi geni I ribosomi dei mitocondri vegetali sedimentano a circa 78S e contengono rrna 18S (subunità piccole) e rrna 26S (subunità grande). Queste dimensioni sono più vicine a quelle degli rrna eucariotici che a quelle degli omologhi batterici (12S e 23S) e molto maggiori rispetto agli rrna dei mitocondri animali (12S e 16S). I mitocondri vegetali inoltre contengono un particolare rrna 5S che è assente dai ribosomi di quasi tutti gli eucarioti.

19 organizzazione insolita dei geni per rrna mitocondriale vegetale: 18S-5S a una certa distanza 26S solitamente, in eubatteri e coloroplasti si ha: 16S-23S-5S.organizzati in cluster

20 RNA transfer e i relativi geni il numero di geni per trna non è sufficiente a produrre tutti i trna necessari alla lettura del codice il numero e il tipo di trna varia da specie a specie, tuttavia è sempre inferiore a quello di mammiferi e funghi dove sono presenti geni per trna alcuni trna sono codificati da geni nucleari e successivamente importati nel mitocondrio (meccanismo sconosciuto) vi è somiglianza tra trna mitocondriali e cloroplastici: ipotesi di loro derivazione da DNA promiscuo plastidico e successiva perdita del gene originale mitocondriale

21 i trna mitocondriali delle angiosperme possono avere 3 derivazioni 1. trna nativi codificati dall mtdna 1. trna di tipo plastidico codificati da DNA promiscuo 1. trna di tipo citosolico codificati dal genoma nucleare e importati dal citosol nel mitocondrio

22 geni che codificano per proteine introni in geni mitocondriali di angiosperme: presenza di introni nella stessa posizione in geni di piante vicine esempio monocotiledoni e gene della citocromo ossidasi introni spesso autocatalitici presenza di una RNA maturasi che consente lo splicing la struttura primaria dei geni dei mitocondri vegetali che codificano per proteine è molto conservata, la somiglianza cala drasticamente al di fuori delle sequenze codificanti.

23 Codice genetico universale e mitocondriale

24 Differenze tra i codici genetici nucleari e mitocondriali di uomo e lievito Codone aminoacido Codice nucleare Codice Codice mitocondriale mitocondriale lievito mammiferi UGA Terminazione Triptofano Triptofano AUA Isoleucina Metionina Isoleucina CUN Leucina Leucina Treonina AGG,AGA CGN Arginina Arginina Terminazione Arginina Arg Terminazione? NB attenzione nella produzione eterologa di proteine mitocondriali

25 Meno del 10% delle proteine che compongono un mitocondrio sono sintetizzate dal DNA mitocondriale Vi sono meccanismi di importazione di proteine verso il mitocondrio e i suoi comparti interni

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27 Cloroplasti:

28 La famiglia dei plastidi Buchannan et al. Fig. 1.44

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30 Foglia Funzione del cloroplasto: sede della fotosintesi negli organismi vegetali sede, non unica, della biosintesi di amminoacidi fenilpropanoidi, sito di azione di erbicidi, incluso il glifosate sede, non unica, della biosintesi degli acidi grassi

31 DNA cloroplastico ctdna Il numero di copie di cpdna per cloroplasto dipende dalla specie ci sono molte copie di cpdna per cloroplasto, generalmente distribuite in un certo numero di regioni nucleoidi. I cloroplasti crescono e si dividono come i mitocondri.

32 Plant Plastid Genome Organization Physical map (e. g. restriction map or DNA sequence) indicates a kb circular genome Large inverted repeat (LIR) commonly kb divides genome into large single copy (LSC) region and small single copy (SSC) region Inversion of genome segments indicates active recombination within the LIR Expansion and contraction of LIR is the primary length polymorphism in land plants (10-76 kb) Conifers and some legumes have no LIR

33 DNA cloroplastico di riso LSC long single copy LIR LIR SSC short single copy

34 Le regioni invertite contribuiscono all eterogeneità dei cpdna

35 L organizzazione genica del DNA cloroplastico Il genoma cloroplastico contiene i geni per tutti gli rrna cloroplastici (16S, 23S, 4,5S e 5S). Il genoma contiene anche i geni che codificano per i trna e per alcune ma non tutte le proteine necessarie per la trascrizione e la traduzione dei geni codificati dal cpdna (quali proteine ribosomali, subunità della RNA polimerasi e fattori di traduzione) o per la fotosintesi. In alcuni geni che codificano proteine e per quelli dei trna ci sono introni. Altre proteine che si trovano nel cloroplasto sono codificate da geni nucleari

36 Una caratteristica del genoma del cloroplasto è quella di contenere 2 copie di ciascuno dei geni per l rrna. Le due serie di geni ribosomali del cloroplasto si trovano in due identiche sequenze ripetute di Kb, orientate nel genoma in senso inverso. In queste due sequenze ripetute ci sono altri geni che così risultano duplicati. La presenza di queste 2 regioni ripetute individua una breve regione a DNA a singola copia (short single copy, SSC) e una regione lunga a singola copia (long single copy, LSC).

37 Tabacco e riso hanno entrambi 30 geni per trna mentre in Marchantia, una epatica, ce ne sono 32. L analisi al calcolatore delle sequenze dei cpdna ha evidenziato circa 100 ORF. Una sessantina di queste sono state correlate con geni che codificano per proteine a funzione nota, mentre per le altre la funzione deve essere ancora definita. Le ORF sono piuttosto conservate nelle piante, almeno per quelle delle quali sono disponibili dati di sequenza.

38 Geni codificati dal DNA plastidico geni di decodificazione del DNA trascrizione: subunità della RNA polimerasi traduzione: RNA ribosomali, trna, fattori di inizio geni implicati nella fotosintesi subunità grande della Rubisco subunità del PSI subunità del PSII complessso citocromo b6-f subunità della ATP sintetasi sintesi della clorofilla altri geni NADH ossido-reduttasi

39 La traduzione nei cloroplasti Per la sintesi delle proteine cloroplastiche sono utilizzati ribosomi 70S specifici dei cloroplasti, che sono composti da una subunità 50S ed una subunità 30S. La subunità 50S contiene una copia per ciascuno degli rrna 23S, 4,5S e 5S. La subunità 30S è costituita da una copia di rrna 16S. ll numero delle proteine ribosomali di ciascuna subunità è meno definito, ma è noto che solo alcune sono codificate nel nucleo, mentre altre sono codificate dal cloroplasto.

40 La sintesi proteica nei cloroplasti assomiglia al processo di sintesi proteica nei procarioti. Il trna per la formil-metionina usato per cominciare la sintesi di tutte le proteine e il cloroplasto utilizza fattori di inizio(if), fattori di allungamento (EF) e di rilascio (RF) specifici del cloroplasto. Per la sintesi proteica è usato il codice genetico universale. I ribosomi cloroplastici, come quelli mitocondriali, sono sensibili a tutti gli inibitori della sintesi proteica nei procarioti mentre risultano resistenti alla cicloesimide che colpisce selettivamente i ribosomi citoplasmatici.

41 La RUBISCO, il più importante enzima plastidiale coinvolto nella fotosintesi è formata da 8 subunità proteiche grandi e 8 subunità piccole. L informazione genica per costruire la subunità grande è contenuta nel DNA dei cloroplasti mentre quella per costruire la subunità piccola nel DNA del nucleo.

42 Importazione di proteine dal citoplasma al cloroplasto

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44 DNA promiscuo L origine degli organelli sarebbe riconducibile all ipotesi dell endosimbionte: un cianobatterio per il cloroplasto e un proteobatterio per i mitocondri. Entrambi hanno mantenuto caratteristiche del loro genoma batterico, ma hanno mantenuto più della loro biochimica che del loro DNA. Trasferimento genico endosimbiontico: i geni sono stati trasferiti dall endosimbionte al nucleo, ma le proteine codificate sono poi reimportate nell organulo tramite segnali di transito e un apparato di import. La regolazione dei due sistemi non è autonoma, anche l organulo è soggetto a meccanismi di regolazione nucleari.

45 Quali geni? I geni cloroplastici sono da 60 a 200 (i cianobatteri non simbionti unicellulari arrivano a 3200) Le proteine nel cloroplasto sono circa Quanti geni nucleari sono chiaramente derivati dal cloroplasto? al momento ne sono stati identificati solo 44. Il genoma dei mitocondri vegetali è più grande del genoma mitocondriale animale. Questa espansione non significa un maggior numero di geni. Sono noti almeno 11 casi di chiara derivazione mitocondriale