CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI POPOLAZIONI DEL PARASSITOIDE PSYTTALIA CONCOLOR

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1 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI POPOLAZIONI DEL PARASSITOIDE PSYTTALIA CONCOLOR 1 1 Vito Simeone, Thaer Yassen, 2 3 Ferdinando Baldacchino & Anna R. Malacrida 1 Istituto Agronomico Mediterraneo di Bari - CIHEAM 2 ENEA-Centro Ricerche Trisaia Dip. BAS - Biotecnologie, Agroindustria e Protezione Salute Sez. BIOTEC-AGRO - Sviluppo Sostenibile del Sistema Agroindustriale 3 Università di Pavia, Dipartimento di Biologia Animale

2 Introduzione La lotta biologica in olivicoltura prevede essenzialmente l'utilizzo dell'imenottero braconide la Psyttalia ( Opius) concolor Szepl., un parassitoide specifico della mosca delle olive. Un momento critico nella lotta biologica con l'applicazione degli insetti utili è la valutazione della reale efficacia in campo dell'entomofago lanciato, tenendo conto che le prestazioni in campo degli insetti utili allevati sono ragionevolmente inferiori a quelle conseguibili in condizioni di laboratorio; valutazione che viene correntemente fatta in base a livelli di parassitizzazione o predazione riscontrati dopo il lancio. Tale valutazione non è però in grado di discriminare l'azione dell'entomofago lanciato rispetto a quella svolta dalla popolazione entomofaga indigena già presente. Questa attività quindi ha permesso di caratterizzare da un punto di vista genetico popolazioni di Psyttalia concolor per il controllo della B. oleae. La distinzione morfologica fra i ceppi allevati in laboratorio e le popolazioni selvatiche di P. concolor è praticamente impossibile. Quindi lo sviluppo di un metodo efficace per distinguere tra di loro è l'utilizzo di tecniche molecolare che si basano sul patrimonio genetico degli individui. Questo scopo lo si è raggiunto tramite l'uso dei marcatori molecolari. Materiali e metodi Nel 4, l'attività è stata concentrata sulla fase preliminare di caratterizzazione della popolazione indigena di P. concolor, quindi sono state raccolte pupe di B. oleae sia dai campi che dagli oleifici e messe o in piastre Petri o in gabbie di plexigass per recuperare il parassitoide in fase di sfarfallamento. Sia in Albania che in Italia, la raccolta delle pupe di mosca ha evidenziato assenza di parassitizzazione e quindi non è stato possibile recuperare individui di P. concolor indigeni. Pertanto per poter procedere alla caratterizzazione genetica delle popolazioni si è dovuto far ricorso a materiale in collezione presso lo IAM-B, raccolto in Italia negli anni precedenti. Al fine di valutare la diversità genetica di P. concolor, è stato effettuato uno studio tramite l'applicazione di DNA fingerprinting RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Tra i marcatori PCR, i RAPD, ottenuti per amplificazione del DNA genomico mediante l'uso di oligonucleotidi ( primer) casuali di piccole dimensioni, sono utilizzati nello studio della diversità genetica di insetti. La PCR effettuata a basse temperature di annealing permette ai primer di ibridarsi su più loci. Le reazioni di amplificazioni sono state effettuate con i seguenti primers: NP1, NP4, D17, 494N, A10 e NP2. I primers che hanno rivelato una marcata variabilità genetica sono stati: NP4, A10 e D17. Il DNA di 15 popolazioni, tra cui otto indigeni pugliesi uno della Basilicata quattro allevati (Bari, Cagliari, Turchia e Guatemala), due indigeni del Medio-Oriente (Libano e Giordania) 24 individui per ogni popolazione, sono stati estratti utilizzando il metodo Baruffi leggermente modificato. Questo protocollo ha mostrato di essere il più adeguato ed efficiente ad ottenere una ottima qualità e quantità di acidi nucleici (DNA) per essere usato successivamente nelle operazioni di amplificazione. Il DNA diluito è stato utilizzato per avviare la reazione di RAPD-PCR. L'amplificazione è stata effettuata con un termociclatore. Dai profili di amplificazione con tre primers (NP4, A10 e D17) sono state derivati matrici per la presenza assenza delle diverse bande RAPD. Tale matrici sono state la base per la stima della varianza molecolare (AMOVA) che identifica la distribuzione della variabilità genetica a livello inter- ed intra popolazione di P. concolor. Il grado di affinità genetica tra le popolazioni naturali e tra queste e ceppi allevati di P.concolor è stato definito dalla stima delle distanze genetiche. Le relazione genetiche tra le popolazioni e i ceppi sono state visualizzate mediante la cluster analysis. Un albero di 79

3 consensus e stato derivato applicando il metodo Unweighted Pair-Group Method Arithmetic average (UPGMA) mediante il programma PHYLIP Risultati e discussioni La tipologia dell' albero evidenzia un ampia affinità tra le popolazione italiane, che appaiono a loro volta, geneticamente correlate con i ceppi allevati in laboratorio, provenienti dell'area mediterranea (Bari, Cagliari e Turchia). Questi tre campioni sono molto simili tra loro suggerendo un origine comune. Le popolazione naturale del Medio Oriente appaiano invece ben differenziate. Il ceppo allevato da Guatemala è molto distante e diverso geneticamente degli altri (Fig. 1). BASILICATA OSTUNI FOGGIA POLIGNANO TRANI BRINDISI VERNOLE Wild Italy 810 TARANTO OTRANTO BARI CAGLIARI TURKEY JORDAN 947 LEBANON GUATEMALA Fig. 1. Albero ottenuto con l'opzione TREE del programma PHYLIP. La differenziazione tra popolazioni e ceppi evidenziata dalla tipologia dell'albero è confermata dai risultati della analysi PCO (Fig. 2). Data l'alta affinità genetica tra il ceppo allevato presso l'istituto Agronomico Mediterraneo di Bari (IAM-B) e le popolazioni naturali italiane non è stato possibile individuare marcatori diagnostichi tra questi campioni (Fig. 3). 80

4 PCoA 0.2 PC oa axis 2 (21.42% ) Middle East Meditteranean reared Guatemala reared Italian wild -0.1 PCoA axis 1 (67.30%) Fig. 2. Grafico bidimensionale (Principal coordinate analysis - PcoA) di 15 popolazioni di P. concolor ottenuti da dati RAPD. M Monopoli Brindisi Taranto Alessano Martano Fig. 3. Gel di agarosio RAPD-PCR mostrante l'alta similarità genetiche tra le popolazioni indigene pugliesi e il ceppo allevato presso lo I.A.M.-B. Utilizzando il primer NP 4 è stato invece possibile individuare un marcatore diagnostico tra il ceppo allevato presso lo IAM-B e le popolazioni naturali del Libano e della Giordania Fig. 4). 81

5 M Ceppo allevato (IAMB) Pop. indigena (Libano) M 260 pb 260 pb Fig. 4. Gel di agarosio RAPD-PCR mostrante la presenza di banda specifica a 260 pb, con primer NP4, nel ceppo in allevamento presso lo I.A.M.-B. ed assente nella popolazione indigena libanese. La banda NP4 260bp presente nello ceppo allevato di IAMB ed invece assente nelle altre due popolazioni indigene (Libano e Giordania) permette di discriminare questo ceppo dalle due popolazioni naturali dell Medio Oriente Questa banda discriminante ha reso possibile lo sviluppo di marcatori molecolari tipo SCAR (Fig. 5). M Lebanon Bari Jordan Salt Jordan Irbid M Fig. 5. Pattern di bande ottenuto in PCR con i primer SCAR. 82

6 La disponibilità di una collezione di P. concolor e la messa appunto di tecniche di diagnostica molecolare ha reso possibile l'avvio della realizzazione di una banca dati relativa alle popolazioni indigene ed allevate. Per rendere confrontabili i dati ottenuti si è proceduto ad una standardizzazione delle procedure di laboratorio come è stato riportato precedentemente. Le foto digitali del gel sono state archiviate in PC, costituendo parte della banca dati. Le posizioni delle bande ottenute in tre esperimenti indipendenti, sono state indicate come presenti (1) o assenti (0) direttamente dalle fotografie dei gel, dopo elettroforesi e colorazione in etidio bromuro e registrati come una matrice binaria. In tale matrice sono stati inclusi tutti i dati relativi alle popolazioni impiegate in questa indagine ottenuti con i tre primer utilizzati. Sono state considerate solo le bande più pulite e riproducibili; quelle meno nitide, che non potevano essere sistematicamente visualizzate, non sono state prese in considerazione. Si rimanda all'allegato 1 la consultazione delle matrici costituenti la banca dati. Conclusioni Il presente lavoro ha permesso di ottimizzare i protocolli per la caratterizzazione genetica di popolazione di P. Concolor; di selezionare tre primers più adatti allo scopo (NP4, A10 e D17); sviluppando un marcatore molecolare, tipo SCAR, diagnostico nel momento in cui si effettueranno lanci in pieno campo. Inoltre si è avviata la costituzione di una banca dati di caratterizzazione genetica di P. concolor. (Alleg.2). 83

7 Allegato 1 MATRICI COSTITUENTI LA BANCA DATI DI PSYTTALIA CONCOLOR

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23 Allegato 2 PROFILI ELETTROFORETICI COSTITUENTI LA BANCA DATI DI PSYTTALIA

24 Primer A10 Bari Turchia Primer A10 Cagliari Bari Primer D17 Bari Cagliari

25 Primer D17 Bari Turchia Primer NP4 Cagliari Bari Primer NP4 Bari Turchia

26 Primer A10 Cagliari Indigeno Libano Primer A10 Cagliari Bari Primer D17 Bari Cagliari

27 Primer D17 Cagliari Libano Primer NP4 Cagliari Bari Primer NP4 Cagliari Indigeno Libano

28 Primer A10 Bari Turchia Primer A10 Wild Lebanon Turkey Primer D17 Wild Lebanon Turkey

29 Primer D17 Bari Turchia Primer NP4 Wild Lebanon Turkey Primer NP4 Bari Turchia

30 Primer A10 Cagliari Indigeno Libano Primer A10 Wild Lebanon Turkey Primer D17 Wild Lebanon Turkey

31 Primer D17 Cagliari Libano Primer NP4 Wild Lebanon Turkey Primer NP4 Cagliari Indigeno Libano