Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology Nguyen, Quoc-Thai

Transcript

1 University of Groningen Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology Nguyen, Quoc-Thai IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2017 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Nguyen, Q-T. (2017). Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Riassunto Gli enzimi dipendenti da flavina (flavo-enzimi) rappresentano catalizzatori molto diffusi in natura ed estremamente versatili, capaci di catalizzare un ampio spettro di reazioni di ossidoriduzione. Nel Capitolo 1 viene riportata una panoramica delle più recenti scoperte in merito a nuovi flavo-enzimi dalle caratteristiche catalitiche inedite. Tra i flavo-enzimi di recente scoperta, alcuni sono stati oggetto della presente tesi di dottorato, come descritto nei capitoli sperimentali (Capitoli 2 5). Questi capitoli forniscono spunti in grado di aprire a nuove possibilità di sfruttare flavo-enzimi come efficienti catalizzatori (ossidativi) provenienti da diverse classi microbiche. L individuazione e la valutazione di nuovi flavo-enzimi richiede un approccio dialogico a cavallo di diversi campi di ricerca, dalla caratterizzazione di nuove sequenze genomiche ad approcci metodologici di chimica proteica, cinetica enzimatica e biologia strutturale. Allo scopo di poterne fare uso a livello di applicazioni biotecnologiche, vengono preferenzialmente identificati enzimi particolarmente stabili, che possano essere prodotti per via ricombinante (per esempio, utilizzando Escherichia coli) e utilizzati direttamente come whole-cell o, perlomeno, facilmente purificabili. Gli enzimi oggetto della presente tesi soddisfano in gran parte questi requisiti. La prima parte (Capitoli 2, 3) descrive lo studio esplorativo di due flavo-proteine ossidative con uno spettro interessante di substrati: la eugenolo ossidasi di Rhodococcus jostii RHA1 (EUGO) e una alcolossidasi del fungo Phanerochaete chrysosporium, responsabile delle cosiddette carie del legno. La seconda parte della tesi riguarda l identificazione di due enzimi di recente scoperta in grado di rigenerare la F 420 H 2 batterica, candidati promettenti per l impiego come biocatalizzatori. L enzima EUGO di R. jostii RHA1 rappresenta un target promettente per la trasformazione ossidativa di composti fenolici grazie alla possibilità di produrre l enzima in E. coli in grandi quantità (160 mg di enzima puro per litro di coltura). Inoltre, EUGO si è dimostrato fortemente termostabile su un ampio range di ph (T m = 65 C da ph 5 a 8) e in presenza di diversi co-solventi (Capitolo 2). L analisi del profilo di substrati ha rivelato che, oltre all ossidazione del vanillil-alcol e all idrossilazione dell eugenolo, EUGO è in grado di catalizzare efficientemente la deidrogenazione di diversi chetoni fenolici come i prodotti naturali gingerone e il chetone di lampone. E interessante notare che l enzima EUGO è anche in grado di catalizzare la risoluzione di una miscela racemica di alcol secondario 4- (1-idrossietil)-2-metossifenolo, con il rispettivo enantiomero-(s) ossidato in modo selettivo. Sono state risolte le strutture cristallografiche dell enzima in complesso con diversi prodotti e inibitori. Sorprendentemente, il confronto delle strutture di EUGO con quella della vanillil alcol ossidasi (VAO) di Penicillium simplicissimum ha rivelato un orientazione dei ligandi ribaltata di 180, indicando come l enzima EUGO possa essere in grado di accettare substrati fenolici recanti due sostituenti This chapter was kindly translated by Dr. Filippo Fiorentini 93

3 94 Riassunto o-metossi. Alla luce di questo, guidati dai dati strutturali, abbiamo testato il 4-allil-2,6-dimetossifenolo (che non è substrato della VAO), dimostrando la sua conversione da parte dell enzima EUGO (Capitolo 2). La recente scoperta di una nuova AOX derivante dal basidiomicete delle carie del legno P. chrysosporium (PcAOX), dimostratasi promettente nell ossidazione del glicerolo, ci ha spinto ad investigare più nel dettaglio questo enzima (Capitolo 3). In particolare, abbiamo dimostrato che PcAOX può essere prodotta con rese eccezionali: è stato possibile ottenere fino a più di 600 mg di proteina pura a partire da 1 L di coltura di E. coli. A quanto ci risulta, PcAOX rappresenta il primo esempio di metanolo ossidasi fungina all interno della superfamiglia Glucosio-Metanolo-Cholina (GMC) ossidoreduttasi che sia stata espressa per via eterologa tramite E. coli. Se, da un lato, PcAOX dimostra efficienze catalitiche di alto livello nei confronto di metanolo ed etanolo come substrati (k cat di circa 18 s 1 ), l attività su glicerolo si è rivelata piuttosto modesta (k obs = 0.2 s 1 in presenza di 4 M glicerolo). La struttura cristallografica di PcAOX nativa è stata risolta ad una risoluzione di 2.4 Å, rivelando come la tasca coinvolta nel legame del substrato sia di dimensioni eccezionalmente piccole e di impossibile eccesso per i solventi. Tali caratteristiche correlano perfettamente con l evidente preferenza per il metanolo come substrato e con la bassa affinità ed attività registrate nei confronti del glicerolo. Sulla base delle informazioni strutturali disponibili, si è proceduto con successo ad un ridisegno razionale dell intorno catalitico dell enzima per migliorarne l efficienza (Capitolo 3). Le reduttasi dipendenti da F 420 H 2 offrono un potenziale come biocatalizzatori in grado di promuovere idrogenazioni selettive di un ampio spettro di composti organici che sarebbero altrimenti recalcitranti ad un attivazione riduttiva, come gli enoni e le immine presenti in diversi composti eterociclici. In studi precedenti sono stati identificati due enzimi che potrebbero offrire la possibilità di ridurre la F 420 : una F 420 :NADPH ossidoreduttasi (FNO) e una glucosio-6-fosfato (G6P) deidrogenasi F 420 -dipendente (FGD). I sistemi di espressione basati su E. coli che sono stati sviluppati possono garantire la routinaria produzione di FDG ed FNO come strumenti deputati alla rigenerazione o alla sintesi di F 420 ridotta (Capitoli 4 e 5). Nel Capitolo 4 viene riportata l identificazione e l espressione di una FDG di R. josttii RHA1 (Rh-FGD1), il primo enzima di questo batterio dipendente da F 420 che sia stato descritto. A differenza della F 420 di Mycobacterium tuberculosis (Mtb-FGD1), che risulta scarsamente espressa per via ricombinante, Rh-FGD1 è stata prodotta con ottime rese (80 mg di enzima puro a partire da 1 L di coltura). Rh-FGD1 è un enzima piuttosto efficiente, con una k cat di 17 s 1 per il G6P. L analisi della struttura di Rh-FGD1 a confronto con quella di Mtb-FGD1 ha evidenziato come il gruppo fosfato della G6P vada ad occupare una tasca con cariche positive formate dalle catene laterali dei residui Lys157, Lys258 e Arg282. L effettiva importanza del ruolo assegnato a tali residui carichi positivamente nel formare la tasca di legame del gruppo fosfato è stato verificato mediante mutagenesi sito-specifica (Capitolo 4). E interessante notare che, quando il glucosio è stato usato come substrato al posto della G6P, il mutante K197N ha mostrato un rapporto k cat /K m leggermente migliore rispetto a quello dell enzima nativo. Mediante uno sforzo ingegneristico più approfondito, sarà possibile ingegnerizzare

4 Riassunto 95 Rh-FGD1 fino ad ottenere un biocatalizzatore ancor più promettente dal punto di vista economico, come ad esempio una glucosio deidrogenasi dipendente da F 420 in grado di sfruttare un co-substrato più economico, come il glucosio. La struttura cristallografica che è stata risolta e riportata in questa tesi può guidare un futuro progetto che miri all ingegnerizzazione selettiva di questo enzima. Successivamente, è stata identificata una FNO termostabile appartenente al batterio mesofilico Thermobifida fusca (Capitolo 5). Questo lavoro rappresenta la prima evidenza sperimentale di un enzima dipendente da F 420 presente in questo batterio. In modo simile a quanto riportato per l enzima Rh-FGD1, è stato possibile esprimere Tfu-FNO per via ricombinante tramite E. coli, con rese fino a 200 mg di enzima per litro di coltura. Dal momento che il NADPH rappresenta un cofattore più costoso e meno stabile del NADH, abbiamo avviato esperimenti di ingegnerizzazione di FNO che mirassero a promuovere l utilizzo di NADH da parte dell enzima grazie ad una rimodulazione dei residui coinvolti nel riconoscimento e discriminazione molecolare fra i due cofattori. Sulla base della struttura cristallografica di FNO in complesso con NADP + (ottenuta con una risoluzione pari a 1.8 Å), sono stati individuati i residui direttamente coinvolti nell interazione con il 2 -fosfato del NADP + (Thr28, Ser50, Arg51 e Arg55). I dati di mutagenesi hanno confermato che questi residui giocano un ruolo importante nel discriminare tra NADP + e NAD +. E interessante notare che il mutante T28A è in grado di aumentare l efficienza cinetica di più di tre volte rispetto all enzima nativo in presenza di NADH, risultando in una k cat piuttosto elevata (5.0 s 1 ). Di conseguenza, l enzima Tfu-FNO e i relativi mutanti rappresentano candidati promettenti al fine di essere impiegati in processi biocatalitici.

5