Olio e farina da Cannabis sativa L. analisi multiscreening di micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e fitofarmaci

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1 Olio e farina da Cannabis sativa L. analisi multiscreening di micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e fitofarmaci P. Fusari P. Rovellini* L. Folegatti D. Baglio A. Cavalieri 1 Divisione SSOG di INNOVHUB - Stazioni Sperimentali per l Industria - Azienda Speciale della Camera di Commercio di Milano 1 ATI Consulting - Milano. *CORRISPONDENZA Dr.ssa Pierangela Rovellini Divisione SSOG Via Giuseppe Colombo Milano Tel Fax address: pierangela.rovellini@mi.camcom.it Il presente lavoro descrive l applicazione di metodi finalizzati alla determinazione di micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli e residui di fitofarmaci nell olio e nella farina ottenuti da Cannabis sativa L. Questa pianta è coltivata per la produzione di fibre tessili e per l estrazione dell olio dai semi ed è utilizzata come alimento e nelle preparazioni di medicina tradizionale per i suoi effetti benefici, quali l abbassamento del colesterolo e della pressione del sangue. Inoltre visto l elevato grado di insaturazione presente nell olio, quest ultimo trova impiego nella produzione di inchiostro da stampa, di conservanti del legno e in detergenti e saponi. Le analisi multiscreening riguardanti le micotossine (aflatossina B1, B2, G1, G2, deossinivalenolo, ocratossina A, zearalenone) e gli idrocarburi policiclici aromatici condotte sull olio e sulla farina di canapa sono risultate negative per tutte le sue componenti. L analisi dei principali ftalati, impiegati nella produzione di materie plastiche, ha evidenziato un contenuto abbastanza elevato di dietilesilftalato nell olio di canapa, probabilmente dovuto al tipo di packaging in cui il campione era conservato. La ricerca dei metalli pesanti (piombo, cadmio, nichel, arsenico e cromo) e di alcuni metalli derivanti da processi industriali (ferro, rame e fosforo) nell olio di canapa non ha riscontrato alcuna presenza per i primi e una minima quantità per i secondi. La farina di canapa è invece risultata essere una fonte potenziale di micronutrienti, quali ferro, manganese e zinco, utili nell alimentazione umana e animale, oltre a possedere un elevata quantità di fosforo altamente assimilabile, mentre le concentrazioni dei composti metallici tossici sono risultate essere inferiori ai limiti di rilevabilità dei metodi analitici. L esecuzione dell analisi multiscreening mirata alla determinazione dei fitofarmaci è risultata positiva per alcuni residui sull olio, sulla farina e sull olio estratto dalla farina, anche se presenti in basse concentrazioni. Parole chiave: Cannabis sativa L., analisi multiscreening, micotossine, ftalati, idrocarburi policiclici aromatici, metalli, residui. Oil and flour of Cannabis sativa L. multiscreening analysis of mycotoxins, phthalates, polycyclic aromatic hydrocarbons, metals and pesticide residues This paper describes the application of multiscreening methods aimed to the determination of mycotoxins, phthalates, polycyclic aromatic hydrocarbons, metals and phytoresidues in oil and flour obtained from Cannabis sativa L. This plant is cultivated for textile fiber production and extraction of oil from seeds and is used in food and folk medicinal preparations for its positive health benefits, including lowering of cholesterol and blood pressure. Moreover, due to the high content of polyunsaturated compounds, hemp seed oil has been used for printer s ink, wood preservative and also for detergents and soaps. The multiscreening analysis regarding mycotoxins (aflatoxin B1, B2, G1, G2, deoxynivalenol, ochratoxin A, zearalenone) and polycyclic aromatic hydrocarbons on oil and 9

2 flour were negative for all components. The analysis of the main phthalates, used in plastic production, showed a fairly high content of diethylhexylphthalate in hemp oil, probably due to the type of packaging in which the sample was stored. The analysis of heavy metals (lead, cadmium, nickel, arsenic and chromium) and some metals from industrial processes (iron, copper and phosphorus) in the oil found no presence for the former and only few amounts of iron, copper and phosphorus. The hemp flour is instead found to be a potential source of micronutrients, such as iron, manganese and zinc, useful in human and animal nutrition, in addition to a high amount of phosphorus highly available, while the concentrations of the toxic metal compounds were below the limit of detection of the analytical methods. Execution of multiscreening analysis for pesticides revealed positive results for certain residues on oil, flour, and oil extracted from the flour, even if at low concentrations. Key words: Cannabis sativa L., multiscreening methods, mycotoxins, phthalates, polycyclic aromatic hydrocarbons, metals and phytoresidues. 10

3 INTRODUZIONE La Cannabis sativa L. è una delle piante più antiche conosciute in medicina e una di quelle più studiate dal punto di vista fitochimico [1-10]. Per migliaia di anni è stata coltivata e utilizzata come un importante fonte alimentare, di fibre e di medicamenti. In particolare in Cina e in Asia già 3000 anni fa i semi di canapa venivano impiegati come alimento dall uomo (crudi, cotti o tostati) e dagli animali (uccelli migratori e roditori) mentre l olio di canapa era usato nell alimentazione e in medicina. A livello industriale la canapa è coltivata per la produzione di fibre ampiamente utilizzate per la fabbricazione di tessuti, corde, carte speciali, reti o sacchi. I semi costituiscono un importante sottoprodotto impiegato per l estrazione di olio e farina mediante processi di spremitura a freddo, o sono utilizzati, una volta decorticati, ad uso umano e animale. I semi di canapa e i prodotti da essi derivati, in aggiunta al loro valore nutrizionale, hanno dimostrato effetti benefici riguardanti l abbassamento del colesterolo ematico, dei trigliceridi, della pressione sanguigna, nella cura delle dermatiti, delle malattie degenerative del sistema immunitario, dell apparato respiratorio e hanno trovato impieghi in campo alimentare sia come integratori che nelle preparazioni della medicina tradizionale. I semi di canapa contengono il 20-25% di proteine che forniscono i nove amminoacidi essenziali per l alimentazione umana, il 25-35% di olio con una composizione in acidi grassi interessante, il 20-30% di carboidrati, il 10-15% di fibre insolubili e sono inoltre particolarmente ricchi in minerali. L olio di canapa contiene oltre l 80% di acidi grassi polinsaturi rappresentati dai due principali acidi grassi essenziali quali l acido linoleico (18:2, ω6) e l acido α-linolenico (18:3, ω3) e dai loro metaboliti biologici quali l acido γ-linolenico (18:3, ω6) e l acido stearidonico (18:4, ω3). Visto l alto grado di insaturazione può essere usato nel settore degli inchiostri, delle vernici, della detergenza e dei saponi. Dal punto di vista nutrizionale una sua caratteristica importante è il rapporto ideale tra gli acidi grassi essenziali ω6/ω3 di 3:1, valore attualmente raccomandato dall Organizzazione Mondiale della Sanità che rende questo olio perfettamente equilibrato per la sua assunzione. Nel campo cosmetico la presenza di acido γ- linolenico lo rende ideale quale olio per il corpo e come ingrediente di creme cosmetiche con alta capacità penetrante nella pelle. La canapa è inoltre conosciuta per il suo contenuto di composti psicoattivi quali i cannabinoidi ed in particolare il tetraidrocannabinolo (δ9-thc) [6], la cui presenza ha provocato il divieto della sua coltivazione in Europa e nel Nord America a partire dal Solo lo sviluppo di varietà di canapa a basso contenuto di THC ha reso possibile la sua reintroduzione e coltivazione a livello industriale a partire dalla fine degli anni 90. In Europa e in Italia oggi è consentito coltivare varietà di canapa il cui contenuto di THC sia inferiore allo 0.2% e per varietà iscritte nel Registro Europeo delle sementi. La legge canadese fissa un tenore massimo di THC pari a 0.3% nelle foglie e di 10 mg/kg nell olio e nella farina. Nel presente lavoro di ricerca abbiamo utilizzato una varietà di semi di canapa dichiarata 0% di THC e ci siamo focalizzati sulla caratterizzazione sia dell olio estratto che della farina dal punto di vista della sicurezza alimentare effettuando le principali analisi multiscreening relative ai contaminanti e ai residui, quali micotossine (sulla farina e sull olio), ftalati (sull olio), idrocarburi policiclici aromatici (sulla farina e sull olio), metalli (sulla farina e sull olio) e fitofarmaci (sulla farina e sull olio). La normativa sui contaminanti e sui residui viene continuamente modificata ed aggiornata allo scopo di includere negli aggiornamenti anche i nuovi pareri EFSA sulla sicurezza alimentare. PARTE SPERIMENTALE CAMPIONI Il campione costituito dai semi di canapa è stato decorticato e pressato a freddo, ottenendo da una parte l olio e dall altra un panello da cui poi è stato ottenuto per macinazione un campione di farina. La resa di estrazione dell olio è risultata essere di 10.1%. L olio grezzo sottoposto ad analisi mostrava un caratteristico colore verde-giallo e un odore di noce tostata, nocciola e frutta immatura. METODI DI ANALISI Nelle Tabelle I e II vengono elencati i parametri ed i metodi utilizzati per l analisi dei contaminanti e dei residui selezionati. 11

4 12 RISULTATI E DISCUSSIONE MICOTOSSINE Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da funghi filamentosi che possono causare manifestazioni di tossicità acuta e cronica negli animali superiori. Per questo tipo di determinazione è stato applicato un metodo interno basato sulla UHPLC-MS/MS [11, 12], che prevede l estrazione diretta su una colonnina Solid Phase Extraction di tipo PPL dell olio disciolto in isottano (1 g/5 ml) e successiva eluizione delle micotossine con cloruro di metilene. Tale soluzione è stata mandata a secco e ripresa con 1 ml di acetonitrile ed iniettata nel sistema analitico. La farina (25 g) è stata addizionata con 100 ml di acetonitrile/acqua (80/20, v/v), messa in ultrasuoni, estratta per 2 ore e successivamente lasciata decantare. Successivamente 2 ml della soluzione estratta sono stati centrifugati a 5000 rpm per 15 minuti, 1 ml è stato poi diluito con altri 3 ml di acqua, filtrato su PVDF 0.20 µm e iniettato. Nella Tabella III sono riassunti i valori ottenuti e i limiti attualmente presenti nei regolamenti vigenti [13-16], riportati come valori minimi e massimi in funzione della matrice. La matrice canapa non è considerata da questi regolamenti. L aflatossina B1, ritenuta la più cancerogena, è risultata inferiore a 0.1 µg/kg, sia nell olio che nella farina, limite minimo riportato nella legislazione, e la somma delle aflatossine è compresa nel range di limiti riportati per le altre matrici (4-20 µg/kg). Lo stesso dicasi per il deossinivalenolo ( µg/kg), l ocratossina A ( µg/kg), e lo zearalenone ( µg/kg). FTALATI Gli esteri dell acido ftalico, conosciuti con il termine di ftalati, sono comunemente impiegati come plasticizzanti nell industria dei polimeri, con la possibilità di aumentare la flessibilità di alcuni materiali. Essi possono quindi migrare nell ambiente circostante e contaminare la matrice contenuta. Sono delle sostanze ubiquitarie e il loro controllo è importante in particolare per l industria alimentare. A livello del corpo umano, una volta introdotti, essi possono essere metabolizzati a monoalchilftalati e ad acido ftalico e i loro metaboliti possono risultare più tossici dei materiali di partenza. Si tratta di sospetti cancerogeni umani e interferenti con l apparato endocrino e riproduttore. Al momento non esistono limiti legali negli oli vegetali per gli ftalati, gli unici limiti si riferiscono alla migrazione in simulanti alimentari; diviene così importante proteggere il consumatore da questo tipo di contaminante [17]. L analisi è stata effettuata solo sull olio di canapa utilizzando un metodo interno [18], basato sull estrazione in triplo dell olio (1 g) con acetonitrile saturo di esano, in presenza di uno standard interno deuterato (DEHP-d4), successiva agitazione su vortex, centrifugazione e concentrazione fino a secchezza. Il residuo è stato ripreso ed iniettato nel sistema di UHPLC-MS/MS. I singoli ftalati sono stati acquisiti con interfaccia ESI in modalità positiva e negativa simultaneamente, sulla base delle loro transizioni in SRM (selective reaction monitoring) [33]. Nella Tabella IV vengono riportati i valori ottenuti in mg/kg per ciascun ftalato, utilizzando come standard esterno una curva di calibrazione in solvente. Lo ftalato che è risultato essere presente in quan-

5 tità maggiore è stato il dietilesilftalato (DEHP), con un contenuto pari a 7.6 mg/kg. Si tratta di una quantità non indifferente e anche se non ci sono limiti nell olio di canapa, l associazione tedesca BNN (Bundesverband Naturkost Naturwaren) [19] ha posto a tutela dei consumatori dei valori di orientamento per questa sostanza pari a un contenuto massimo di 5 mg/kg in olio definito biologico, calcolati sulla base di una media giornaliera del consumo di grassi. Sarà necessario controllare durante il processo di lavorazione e di confezionamento che avvenga il minor contatto possibile con il materiale plastico. Nella Figura 1 viene riportato il tracciato cromatografico relativo alla determinazione degli ftalati nell olio di canapa. IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI (IPA) Gli idrocarburi policiclici aromatici sono un altro gruppo di contaminanti derivanti dalla combustione incompleta del materiale organico che sono continuamente rilasciati nell atmosfera da fonti naturali e antropogeniche. Attraverso l atmosfera queste sostanze possono precipitare e contaminare le coltivazioni, trasferendosi facilmente nei prodotti alimentari. La tradizione di essiccare i semi oleaginosi per contatto diretto con i gas di combustione può incrementare enormemente il contenuto degli IPA. Al momento il contenuto di tali sostanze negli oli edibili è controllato dal Regolamento CE 835/2011 [20] e riguarda il contenuto di benzo(a)pirene e la somma di 4 IPA (benzo(a)antracene, crisene, benzo(b)fluorantene e benzo(a)pirene); tali limiti sono riferiti agli oli vegetali in generale destinati al consumo umano diretto. Questo tipo di determinazione è stata eseguita mediante un metodo interno di HPLC-FLUORIME- TRIA, [21-23], sia sull olio che sulla farina. L olio (2 g) è stato diluito in una soluzione di isottano/cicloesano (1/2, v/v) (10 ml) con l aggiunta di benzo(b)crisene come standard interno. Gli idrocarburi policiclici aromatici sono stati separati dall olio e concentrati mediante purificazione su colonnina solid phase extraction di tipo PPL (1 g/6 ml), successivamente sono stati eluiti con cloruro di metilene, portati a secchezza e ripresi in acetonitrile/isopropanolo (80/20, v/v) prima di essere iniettati nel sistema cromatografico. Ciascun componente è stato identificato in base al tempo di ritenzione relativo a quello dello standard interno e in base a caratteristiche lunghezza d onda di emissione e di eccitazione in fluorescenza. La farina di canapa è stata invece addizionata dello standard interno e successivamente di una soluzione di isottano/cicloesano (1/2 v/v) ed estratta per 3 volte in bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. I surnatanti riuniti, dopo essere stati filtrati su sodio solfato anidro per l eliminazione dell eventuale quantità di acqua presente, sono stati purificati con la stessa procedura applicata all olio. Nella Tabella V vengono riportati i valori riscontrati 13

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7 sia per l olio che per la farina di canapa. Tali valori rappresentano la media di due determinazioni indipendenti. Sia l olio che la farina dal punto di vista di questi contaminanti sono risultati essere all interno dei limiti di legge attuali. Nelle Figure 2 e 3 vengono riportati i tracciati relativi alla determinazione degli idrocarburi policiclici aromatici dell olio e della farina di canapa rispettivamente. METALLI I metalli presenti negli oli alimentari possono derivare da contaminazioni ambientali (principalmente i metalli pesanti quali piombo, cadmio, nichel, arsenico e cromo), oppure da processi industriali a cui il seme è sottoposto (ferro, rame, nichel e fosforo). I metalli analizzati nel campione di farina di canapa includono macronutrienti, micronutrienti e metalli pesanti. I metodi di analisi impiegati per gli oli sono specifici per ogni metallo e sono metodi ISO o AOAC, dove disponibili, oppure metodi interni validati che impiegano l assorbimento atomico con fornetto di grafite per la determinazione dei metalli direttamente sul campione di olio [25, 32]. Nel caso della farina i metodi interni utilizzati, anch essi validati e specifici per ogni metallo, prevedono una preventiva mineralizzazione del campione con acido nitrico concentrato. Le analisi dei metalli sia nell olio che nella farina di canapa sono state condotte impiegando uno spettrofotometro ad assorbimento atomico munito di fornetto di grafite con correzione del rumore di fondo mediante effetto Zeeman longitudinale e utilizzo di tubi di grafite pirolitica riscaldati trasversalmente con piattaforma integrata (THGA endcaps). I programmi di temperatura utilizzati per i processi di pirolisi e di atomizzazione dei diversi metalli sono specifici e diversi tra loro a seconda se le analisi vengono condotte in fase organica o in fase acquosa. L introduzione del campione è stata realizzata con un autocampionatore e il volume iniettato è stato di 10 µl per la fase organica e di 20 µl per le analisi in fase acquosa ad una temperatura iniziale del fornetto di 50 C. Per la mineralizzazione del campione di farina è stato utilizzato un sistema a microonde a modo singolo utilizzando un programma di mineralizzazione che raggiunge la temperatura di 210 C in 5 minuti, con una pressione massima ammissibile di 400 psi e il mantenimento di tale temperatura per 3 minuti. 15

8 16 Nello specifico 0.3 g di campione sono stati pesati in un contenitore di quarzo e addizionati di 5 ml di acido nitrico concentrato (69%) superpuro. Alla fine della mineralizzazione il campione è stato trasferito in un matraccio e portato a volume di 10 ml con acqua bidistillata, quindi sono state eseguite ulteriori diluizioni del campione con acqua in modo da avere delle soluzioni finali con una concentrazione di acido nitrico intorno allo 0.3%. I vari metalli presenti nel campione di olio e farina di canapa sono stati determinati mediante calibrazione con standard esterni. Le concentrazioni dei metalli nel campione di olio di canapa sono riportate in Tabella VI. Come si può notare, nel campione di olio analizzato non sono presenti metalli pesanti, le cui concentrazioni sono inferiori al limite di rilevabilità dei metodi analitici. Nel caso di oli destinati ad uso alimentare, il contenuto di piombo e di cadmio è regolamentato da una legge Europea (Regolamento CE 1881/2006 e successive modifiche [13]) che stabilisce dei limiti massimi ammissibili su varie matrici alimentari. Nello specifico, nel caso di oli e grassi il contenuto massimo di piombo è fissato a 0.10 mg/kg, mentre per quanto riguarda il cadmio non è contemplato un limite per le sostanze grasse. La norma CODEX STAN del Codex Alimentarius [24] per oli e grassi alimentari stabilisce un limite massimo per il piombo e per l arsenico di 0.1 mg/kg. La stessa norma fissa dei valori massimi anche per il ferro e il rame e precisamente per oli e grassi pressati a freddo la concentrazione massima ammissibile

9 è di 5.0 mg/kg per il ferro e 0.4 mg/kg per il rame. Nel campione da noi analizzato i valori di ferro e di rame sono nettamente inferiori a quelli riportati nella norma CODEX. Il fosforo è presente negli oli vegetali principalmente come fosfolipide, la cui concentrazione è un parametro importante da monitorare specialmente durante il processo di raffinazione, in quanto i fosfolipidi tendono a formare emulsioni che provocano problemi agli impianti sia durante le fasi di neutralizzazione sia nelle fasi di stoccaggio dell olio stesso con formazione di gomme insolubili nei serbatoi, nelle tubazioni e nei filtri [25]. Il contenuto di fosforo nel campione di olio di canapa analizzato è di 4.4 mg/kg, un valore basso, considerando il fatto che durante il processo di spremitura a freddo il fosforo contenuto nei semi finisce principalmente nel panello di estrazione e non nell olio. La farina di canapa contiene una buona quantità di fosforo totale e precisamente 1.6% nel campione analizzato. La maggior parte di questo fosforo è presente in forma assimilabile per le specie animali, in quanto non è legato all acido fitico, la forma di stoccaggio del fosforo per le piante ed i semi. In Tabella VII sono riportati i valori dei metalli contenuti nella farina di canapa. Come si può notare la farina di canapa è ricca in ferro, manganese, zinco e rame, i cui valori riscontrati nel campione in esame corrispondono a quelli riportati in letteratura per i semi di canapa [3, 26]. Per quanto riguarda il vanadio e il selenio, i valori riscontrati nel campione sono inferiori al limite di rilevabilità dei rispettivi metodi di analisi. Le concentrazioni dei composti metallici tossici contenuti nella farina di canapa sono ampiamente inferiori ai limiti ammessi nei prodotti alimentari, ed in alcuni casi inferiori al limite di rilevabilità dei metodi analitici. Un aspetto riguardante i metalli pesanti è il possibile utilizzo della canapa come fitorimediatore di terreni contaminati [27, 28]. FITOFARMACI È stato eseguito lo screening per la determinazione di alcuni residui di fitofarmaci regolamentati attualmente dal Reg. CE 396/2005 e successive modifiche [29]. Per la presente analisi è stata utilizzata la strumentazione UHPLC con rivelatore a triplo quadrupolo. È stato utilizzato un protocollo interno, validato secondo la procedura SANCO 10684/2009, sviluppato in precedenza [30] attualmente aggiornato e in corso di pubblicazione [31]. L analisi è stata condotta sull olio, sulla farina e sull olio estratto dalla farina. L olio è stato estratto con acetonitrile e l analisi quantitativa è stata effettuata utilizzando una curva di calibrazione esterna in presenza di uno standard interno deuterato quale il Malathion-D6. Non è stata eseguita una curva di calibrazione esterna in matrice in quanto non disponibile una matrice da considerare bianco a cui aggiungere gli standard. L effetto matrice per questo tipo di analisi è molto importante, in quanto si possono avere fenomeni di soppressione o di esaltazione. Nella Tabella VIII sono stati riportati i valori ottenuti dei residui considerati. Nel regolamento citato e nelle successive modifiche non esistono limiti precisi per la matrice canapa (sia olio che farina); si assume come regola generale che tali contenuti debbano essere inferiori a mg/kg. Osservando i dati ottenuti dalla media di due determinazioni indipendenti, i residui quali il chlorpyrifos-methyl e trifluralin sono risultati superiori a mg/kg nell olio di canapa, i residui quali amitraz, chlorpyirfos-methyl, fenvalerate e trifluralin sono risultati superiori a mg/kg nella farina, i residui quali amitraz, chlorpyrifos-methyl, methiocarb e phosalone, sono risultati superiori a mg/kg sull olio estratto dalla farina. CONCLUSIONI In conclusione, per quanto riguarda le micotossine, lo screening di questo tipo di composti provenienti dalla presenza di muffe, condotto sull olio e sulla farina di canapa è risultato negativo per tutte le sue componenti (aflatossina B1, B2, G1, G2, deossinivalenolo, ocratossina A, zearalenone) sia per l olio che per la farina. Dall esecuzione dell analisi multiscreening riguardante i principali ftalati impiegati nelle materie plastiche eseguita solo sull olio è risultato un contenuto abbastanza elevato di dietilesilftalato, superiore a quello raccomandato per l olio biologico. Il campione consegnatoci era in un bidone di plastica e occorrerà in futuro prevedere il confezionamento in materiale inerte, quale il vetro, per garantire la non contaminazione da parte di questo tipo di sostanze. Sia l olio che la farina sono risultati esenti dalla con- 17

10 18 taminazione di idrocarburi policiclici aromatici, derivanti dai processi di combustione ed ubiquitari. La ricerca dei metalli pesanti (piombo, cadmio, nichel, arsenico e cromo) nell olio di canapa non ha riscontrato alcuna presenza, essendo tali valori inferiori ai limiti di rilevabilità dei metodi. La ricerca di alcuni metalli derivanti da processi industriali (ferro, rame e fosforo) ha rilevato valori molto bassi che non comportano conseguenze sulla stabilità dell olio. La farina di canapa è invece risultata essere una fonte potenziale di micronutrienti, quali ferro, manganese e zinco, utili nell alimentazione umana e animale, oltre a possedere un elevata quantità di fosforo (1.6%) altamente disponibile. Le concentrazioni dei composti metallici tossici contenuti nella farina di canapa sono ampiamente inferiori ai limiti ammessi nei prodotti alimentari a salvaguardia della salute umana ed animale. Dall esecuzione dell analisi multiscreening mirata alla determinazione dei fitofarmaci è risultata positiva la presenza di alcuni residui, in particolare per l olio (chlorpyriphos-methyl e trifluralin), per la farina (amitraz, chlorpyiriphos-methyl, fenvalerate e trifluralin), per l olio estratto dalla farina (amitraz, chlorpyriphos-methyl, methiocarb e phosalone). BIBLIOGRAFIA [1] K. Sacilik, R. Ozturk, R. Keskin, Some physical properties of hemp seed. Biosynthesis Engineering, 86, , (2003). [2] C.E. Turner, M.A. Elsohly, E.G. Boeren, Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents. J. Nat. Prod, 43, , (1980). [3] J. C. Callaway, Hempseed as a nutritional resource: an overview, Euphytica, 140, 65-72, (2004). [4] M. Piccioni, Dizionario degli alimenti per il bestiame Ed. EDAGRICOLE. 5^ Edizione, (1989). [5] F. V. Dulf, C. Bele, S. Spinean, V. S. Chedea, G. Zegrean, C. Socaciu, Comparative studies on

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