Metabolismo dei carboidrati III

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1 Prof. Giorgio artor Metabolismo dei carboidrati III Ciclo di Krebs Copyright by Giorgio artor. All rights reserved. B09-III - Versione /04/ :52 Indice Glicogeno Metabolismo del Glicogeno C 2 C 2 P C Gluconeogensi Fermentazione lattica (Anaerobiosi) 2 Lattato D-Glucoso 2ADP + 2Pi 2 Fruttoso-1,6-difosfato 2ATP 2AD 2 2 Piruvato 3 C 2AD Fermentazione alcolica (Anaerobiosi) 2 C etanolo Glicolisi Piruvato Acetil- iboso-5-fosfato Ciclo dei pentosi 3-fosfogliceraldeide 2 AD ssidazione aerobica Ciclo di Krebs Fosforilazione ossidativa 6 C ADP + Pi + + ATP gsartor 1

2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 2

3 Aerobiosi Anaerobiosi 2 Glicogeno 3 C Metabolismo del Glicogeno Gluconeogensi Fermentazione lattica (Anaerobiosi) 2 Lattato 2 Piruvato 3 C C 2 D-Glucoso 2ADP + 2Pi 2 Fruttoso-1,6-difosfato 2ATP 2 Aerobiosi 2AD 2AD Fermentazione alcolica (Anaerobiosi) 2 C etanolo Glicolisi Piruvato Acetil- C 2 P 3 -- iboso-5-fosfato Ciclo dei pentosi 3-fosfogliceraldeide 2 AD ssidazione aerobica Ciclo di Krebs Fosforilazione ossidativa 6 C ADP + Pi + + ATP gsartor 3

4 Aerobiosi In condizioni aerobiche il piruvato prodotto dalla glicolisi e dalla degradazione degli aminoacidi è ossidato a 2 e C 2 nella respirazione cellulare. Ciò avviene in tre stadi Produzione di acetil- (decarbossilazione del piruvato) ssidazione dell acetil- a C 2 (Ciclo di Krebs) Trasferimento di elettroni e fosforilazione ossidativa (produzione di 2 e ATP con consumo di 2 ). v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 4

5 Piruvato Produzione di acetil- (decarbossilazione del piruvato) Trasporto del piruvato Il piruvato è trasportato all interno della matrice mitocondriale dove viene ossidato ad acetil dal complesso enzimatico piruvato. Il piruvato viene trasportato attraverso la membrana mitocondriale attraverso un trasportatore specifico che lo scambia con ioni -. La membrana esterna mitocondriale permette il passaggio a ioni e piccole molecole e contiene canali anionici voltaggio dipendenti (VDAC: voltage dependent anion channels). v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 5

6 Mitocondrio v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Mitocondrio v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 6

7 I mitocondri v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Acetil- C 3C 3 P P - 2 Acetile β-mercaptoetanolamina Acido Pantotenico 3 C C 3C 3 P Adenosina-5'-difosfato P 2 Acetil- v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 7

8 Acetil- - Acetile β-mercaptoetanolamina Acido pantotenico Adenosina-5 -difosfato Acetil- v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Complesso piruvato Il complesso piruvato è un gruppo di enzimi associati non covalentemente che catalizzano la decarbossilazione del piruvato e formazione di Acetil-. La reazione forma contemporaneamente AD trasferendo uno ione - al. Il AD passa gli elettroni alla catena respiratoria La reazione ha un G = kj/mol (essenzialmente irreversibile). AD+ AD C 3 TPP, Lipoato, C 3 C 2 + Complesso piruvato (E 1 + E 2 + E 3 ) v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 8

9 Complesso piruvato Il complesso piruvato catalizza cinque reazioni sequenziali, richiede tre enzimi e cinque coenzimi. I cinque coenzimi sono: Il e il sono trasportatori di elettroni. La TPP trasferisce il gruppo acetile al lipoato. Il lipoato è trasportatore di elettroni e di acili. Il è il trasportatore di acili, lega in modo covalente il gruppo acilico attraverso un legame tioestere ad alta energia. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III I reagenti e i prodotti AD+ C 3 C 2 Idrossietil-TPP C 3 TPP C TPP Piruvato E 1 Lipoamide Diidrolipoil transacetilasi E 2 3 C Diidrolipoil E 3 C 3 Diidrolipoamide AD Acetil-diidrolipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 9

10 Le cinque reazioni nel complesso AD+ C 3 C 2 Idrossietil-TPP C 3 C TPP TPP 1 2 Piruvato E 1 Lipoamide 3 C Diidrolipoil transacetilasi E 2 4 Diidrolipoil E 3 3 C 3 5 Diidrolipoamide AD Acetil-diidrolipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III I tre enzimi del complesso AD+ C 3 C 2 Idrossietil-TPP C 3 TPP C TPP Piruvato E 1 Lipoamide Diidrolipoil transacetilasi E 2 3 C Diidrolipoil E 3 C 3 Diidrolipoamide AD Acetil-diidrolipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 10

11 I cinque coenzimi AD+ C 3 C 2 Idrossietil-TPP C 3 TPP C TPP Piruvato E 1 Lipoamide Diidrolipoil transacetilasi E 2 3 C Diidrolipoil E 3 C 3 Diidrolipoamide AD Acetil-diidrolipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III I cinque coenzimi Base di hiff ridotta ibosio in forma aperta (ossidato) + z (ridotto) AD+ + - (+ + 2e-) AD Protone acido Lipoamide e- Tiamina pirofosfato (TPP) Diidrolipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III 22 gsartor 11

12 Il complesso piruvato PDC consiste in tre enzimi: piruvato EC (E 1, arancio) (B), diidrolipoil transacetilasi EC (E 2, verde) (A), diidrolipoil EC (E 3, violetto) (C). I tre enzimi In E. coli il complesso consiste in 24 coppie di E 1, 24 coppie di E 2 e di 12 coppie di E 3. E 2 funziona come core del complesso (C). v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III I tre enzimi gni coppia di E 2 contiene tre molecole di lipoato legate covalentemente. Il lipoato ha un braccio flessibile che trasporta le molecole di acetile da un sito attivo ad un altro. E 1 ha come coenzima il molecola di TPP ed E 3 ha come coenzima il. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 12

13 Piruvato (E 1 ) EC ' C 3 ' C 3 ' C C + + C 3 TPP C 3 + Gli intermedi rimangono legati al complesso. Il piruvato reagisce con il TPP legato a E 1 e viene decarbossilato al derivato idrossietil-tpp (carbanione reattivo stabilizzato per risonanza). ' C 3 + C C 3 C 2 ' C 3 C 3 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Piruvato (E 1 ) EC Mg ++ TPP 1L8A v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 13

14 Piruvato (E 1 ) EC Cavità Carbanione TPP 1L8A v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Piruvato (E 1 ) EC TPP 1I4 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 14

15 Piruvato (E 1 ) EC TPP 1I4 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Piruvato (E 1 ) EC Cavità Carbanione 1I4 TPP v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 15

16 Diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) ' C 3 + C ' 3 + ' C C C C 3 C 3 C 3 Diidroacetilipoamide Lipoamide Il gruppo idrossietile derivato da idrossietil-tpp è trasferito al lipoato (legato ad una is di E 2 ) come acetile, attraverso l attacco nucleofilo del carbanione sull atomo di zolfo della lipoamide. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) C ' 3 C C 3 Diidroacetilipoamide Il braccio del lipoato si muove sul sito di legame del acetil- e ne transesterifica il gruppo formando Acetil. 3 C C 3 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 16

17 Diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) EC Dominio catalitico v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) EC Dominio catalitico Acetil Lipoamide v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 17

18 Diidrolipoil (E 3 ) 2 + Il lipoato ridotto viene riossidato dall E 3 utilizzando il che si riduce a 2. Il 2 viene riossidato dal che si riduce a AD e + i rigenera la piruvato v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Diidrolipoil (E 3 ) EC LPV v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 18

19 Diidrolipoil (E 3 ) EC v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III La diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) è centrale in questo meccanismo. Il braccio flessibile del lipoato: lega il gruppo acetile e lo trasferisce al e accetta due elettroni dalla piruvato (E 1 ) e li trasferisce al diidrolipoil (E 3 ). v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 19

20 Legame del piruvato E 1 ' 3 C + C C 3 C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Decarbossilazione del piruvato E 1 ' 3 C + C C 3 C 2 C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 20

21 Formazione di diidroacetillipoamide E 1 ' 3 C + C 3 C C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Legame del Coenzima A E 1 ' 3 C + C 3 C C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 21

22 Formazione di Acetil- E 1 ' 3 C + C 3 C C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III ssidazione della diidrolipoamide E 1 ' 3 C + C Cys C 3 C 3 Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 22

23 iduzione del E 1 ' 3 C + C C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Legame del E 1 ' 3 C + C + 2 C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 23

24 iduzione del a + E 1 ' 3 C + C C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III itorno al punto di partenza E 1 ' 3 C + C C 3 C 3 C 3 Cys Cys E 3 E 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 24

25 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III E 1 E 2 E 3 E 1 E 2 E 3 + E 1 E 2 E 3 E 1 E 2 E 3 E 1 E 2 E 3 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 25

26 Controllo della piruvato Inibizione competitiva da prodotti AD compete con in E 3 Acetil- compete con - in E 2 La concentrazione dei due coenzimi regola anche la direzione della catalisi di E 2 e E 3. egli eucarioti E 1 può essere fosforilato da una chinasi attivata dalla forma acetilata di E 2 La forma fosforilata di E 1 è inattiva mentre la forma defosforilata è attiva. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Controllo della piruvato E 1 E 2 E 3 ADP 2 Ca ++ (alto Mg ++ ) Piruvato, ADP, K + E 1 E 2 E 3 Piruvato chinasi Mg ++ Ca ++ Piruvato fosfatasi Acetil- AD ATP P 4 -- C 2 E 1 E 2 E 3 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 26

27 Controllo della piruvato 3C TP P C 3 3 C C 3 TPP C E 31 E 2 E 3 3 C C2 TPP C 3 3 C C3 E 1 E 2 E 3 + 3C 3 C TPP CE 3 1 E 2 E C C 3 3 C TPP C E 3 1 E 2 E 3 TPP 3C 3 C CE 3 1 E 2 E 3 C 3 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 27

28 Ciclo di Krebs Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) Ciclo dell acido citrico ssidazione dell acetil- a C 2 Krebs e Lipmann Premio obel per la Medicina 1953 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 28

29 Ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs è al centro del metabolismo. Le vie degradative (catabolismo) lo alimentano, le vie sintetiche (anabolismo) ne usano i componenti. È una via AFIBLICA, opera infatti sia nel catabolismo che nell anabolismo cellulare. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs Tutte le reazioni avvengono nella matrice mitocondriale. ei mitocondri vi sono anche gli enzimi della fosforilazione ossidativa e quelli della ossidazione degli acidi grassi e degli aminoacidi. Acetil GDP + Pi C GTP v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 29

30 Krebs and Johnson (1937) The role of citric acid in the intermediate metabolism in animal tissues. Enzymologica 4: v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs Acetil C C 3 3 C Piruvato ssalacetato Malato Citrato Fumarato 2 2 uccinato cis-aconitato uccinil GTP GDP + Pi α-chetoglutarato C 2 + ssalosuccinato Isocitrato + 2 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 30

31 Ciclo di Krebs + Acetil C 2 2 Malato Fumarato ssalacetato C 3 Citrato 3 C Piruvato 2 2 uccinato GTP uccinil GDP + Pi α-chetoglutarato C 2 + ssalosuccinato cis-aconitato Isocitrato C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 31

32 Ciclo di Krebs + Acetil C 2 2 C 3 3 C ssalacetato ucleotidi trifosfati 2 Equivalenti riducenti 2 2 GTP GDP + Pi 2C 2 C C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs + C 2 2 C 3 3 C Malato EC Fumarasi EC Citrato sintasi EC uccinato EC uccinil sintetasi EC EC EC GTP GDP + Pi α-chetoglutarato EC Isocitrato EC C 2 + C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 32

33 Ciclo di Krebs + C 2 2 C 3 3 C Malato EC Fumarasi EC Citrato sintasi EC uccinato EC uccinil sintetasi EC Deidrogenasi EC EC GTP GDP + Pi α-chetoglutarato EC Isocitrato EC C 2 + C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs + C 2 2 GTP GDP + Pi 2 uccinil sintetasi EC Malato EC Fumarasi EC uccinato EC C α-chetoglutarato EC C 3 Citrato sintasi EC Isocitrato EC EC C EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 33

34 Ciclo di Krebs + C 2 2 C 3 3 C GTP GDP + Pi 4 + C 2 + C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs ALIMETAZIE IPITI del CICL ECD PA di PDUZIE di EEGIA5 1 PEPAAZIE 2 del CICL 3 4 PIM PA di PDUZIE di EEGIA v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 34

35 Ciclo di Krebs 2 C 4 C 4 + C 4 C 2 C 3 C 2 C 6 3 C 2 2 C 4 C 6 2 GTP GDP + Pi C 4 C C C 5 C 6 C 6 + C 1 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 35

36 Citrato sintasi (EC ) 2 2 Fumarasi EC uccinato EC uccinil sintetasi EC Malato EC ssalacetato Acetil C 2 C 3 Citrato sintasi EC Citrato EC C EC GTP GDP + Pi + α-chetoglutarato EC C 2 Isocitrato EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Citrato sintasi (EC ) 2 2 Fumarasi EC uccinato EC uccinil sintetasi EC Malato EC ssalacetato Acetil C 2 C 3 Citrato sintasi EC Citrato GTP α-chetoglutarato GDP + Pi Isocitrato Quando lega ossalacetato EC cambia conformazione, EC C i crea il sito per 2 acetil-, L ossalacetato non è più accessibile + AD all acqua. + + EC C EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 36

37 Citrato sintasi (EC ) Quando lega ossalacetato cambia conformazione, Ci crea il sito per acetil-, L ossalacetato non è più accessibile all acqua. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Citrato sintasi (EC ) ssalacetato Acetil- v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 37

38 Citrato sintasi (EC ) La condensazione del ossalacetato con acetil- porta alla formazione di citril- È una catalisi acido base che coinvolge is274 e Asp375. L idrolisi del legame tioestere nel citril- porta alla formazione di citrato e -. La reazione è spontanea a causa dell idrolisi del legame tioestere (-31.5 kj/mol) che coinvolge is is 320 is 274 ssalacetato Asp 375 Citrato 2 is 320 is- 320 is C Asp 375 is 274 Asp 375 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Citrato sintasi (EC ) La condensazione del ossalacetato con acetil- porta alla formazione di citril- È una catalisi acido base che coinvolge is274 e Asp375. L idrolisi del legame tioestere nel citril- porta alla formazione di citrato e -. La reazione è spontanea a causa dell idrolisi del legame tioestere (-31.5 kj/mol) che coinvolge is v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 38

39 Citrato sintasi (EC ) 2 Piruvato carbossilasi Acetil C 2 C 3 2 uccinato EC La regolazione della citrato sintasi è data EC La concentrazione uccinil di ossalacetato è limitante, sintetasi EC EC GTP α-chetoglutarato GDP + Pi Isocitrato EC In mancanza di ossalacetato EC si accumula C 2 Acetil-, + + carbossilasi a produrre ossalacetato. + Malato Citrato sintasi EC EC Fumarasi ssalacetato EC Citrato dalla disponibilità di substrati, L ossalacetato è anche substrato della gluconeogenesi, La presenza di Acetil- stimola la piruvato C 2 C 3 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Citrato sintasi (EC ) 1cts v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 39

40 (EC ) + C uccinato EC Malato EC Fumarasi EC uccinil sintetasi EC C 3 Citrato sintasi EC Citrato EC C cis-aconitato EC GTP GDP + Pi + α-chetoglutarato EC C 2 Isocitrato EC Isocitrato + C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III (EC ) Catalizza la conversione stereospecifica del 2 citrato in + isocitrato attraverso una Malato deidratazione e una reidratazione, EC Fumarasi EC L intermedio cis-aconitato non è rilasciato dal sito attivo, C 3 Citrato sintasi EC C 2 Citrato 2 2 EC el sito attivo vi uccinato è un cluster Fe (Fe EC ) cis-aconitato Tre degli ioni Fe sono complessati uccinil da un di tre Cys, sintetasi il quarto è il EC EC sito che lega il substrato. GTP α-chetoglutarato Isocitrato GDP + Pi Isocitrato EC prodotto viene rimosso, il G si EC C 2 avvicina a zero a concentrazioni AD reali Il G della reazione è positivo, il 3 C C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 40

41 (EC ) Cys Fe Cys Fe Fe Cys Fe v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III (EC ) Fe Fe Asp- 100 is+ 101 Fe Fe Arg er 642 Citrato Fe Fe Asp- 100 is+ 101 Fe Arg+ 580 Fe 2 3 er 642 (2,3)-Isocitrato Arg+ 580 Arg+ 580 er 642 er 642 Asp- 100 Asp ovesciamento di is 101 is 101 Fe Fe Fe Fe Fe Fe cis-aconitato intermedio Fe Fe v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 41

42 (EC ) v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III (EC ) Cys Fe Cys Fe Fe is101 Cys Fe Asp100 Cys Arg580 er642 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 42

43 (EC ) trans-aconitato v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III (EC ) v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 43

44 (EC ) 7acn v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Isocitrato (EC ) + C 2 2 C 3 3 C Malato EC Fumarasi EC Citrato sintasi EC uccinato EC EC uccinil sintetasi EC EC GTP GDP + Pi α-chetoglutarato Isocitrato Isocitrato EC α-chetoglutarato EC ssalosuccinato C C 2 Mg ++ v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 44

45 Isocitrato (EC ) C 2 Catalizza la decarbossilazione AD ossidativa del isocitrato, + + C 3 C La porzione nicotinamidica 3 2 del (o del ADP + in un isoenzima) ossida il gruppo Malato Citrato a carbonile, sintasi EC i forma l intermedio EC Fumarasi ossalosuccinato nel quale vi è EC l interazione con lo ione Mg ++ (Mn ++ ), 2 Il gruppo C - 2 non interessato nella formazione del uccinato EC complesso esce come C EC , i forma α chetoglutarato. uccinil sintetasi EC EC GTP GDP + Pi α-chetoglutarato Isocitrato Isocitrato EC α-chetoglutarato EC ssalosuccinato C C 2 Mg ++ v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Isocitrato (EC ) C 2 La reazione è altamente AD spontanea, sia il processo di + + C 3 C decarbossilazione che quello di ossidazione sono 3 2 spontanei ( G = kj/mol). Malato Citrato sintasi EC L isocitrato EC è regolata: Fumarasi EC Attivata allostericamente da ADP (ATP antagonista) 2 Attivata 2 da Ca ++ e (AD antagonista) uccinato EC Quando il rapporto EC ATP/ADP è basso il ciclo di Krebs è attivo. uccinil sintetasi EC EC GTP GDP + Pi α-chetoglutarato Isocitrato Isocitrato EC α-chetoglutarato EC ssalosuccinato C C 2 Mg ++ v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 45

46 Isocitrato (EC ) 3blw v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Isocitrato (EC ) Isocitrato Mg ++ Esce come C 2 ADP + C- ossidato a C= Isocitrato v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 46

47 α-chetoglutarato (EC ) + C 2 2 C 3 3 C Malato EC Fumarasi EC Citrato sintasi EC GTP GDP + Pi uccinil sintetasi EC uccinil α-chetoglutarato EC uccinato EC α-chetoglutarato C 2 Isocitrato EC EC EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III α-chetoglutarato (EC ) C 2 È un complesso enzimatico che converte + l α-chetoglutarato a succinil- e C 2. C 3 3 C 2 La reazione produce AD e conserva l energia nel legame Malato Citrato sintasi tioestere EC EC Fumarasi La reazione è spontanea ( G = kj/mol). EC Meccanismo quasi identico a quello del complesso piruvato 2 2 (E 1, E uccinato 2, E 3 ) EC E 2 ed E 3 sono conservati nei due complessi enzimatici, EC E 1 ha diversa specificità di substrato. GTP GDP + Pi uccinil sintetasi EC uccinil α-chetoglutarato EC α-chetoglutarato C 2 + Isocitrato EC EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 47

48 α-chetoglutarato (EC ) v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III uccinil sintetasi (EC ) + C 2 2 C 3 3 C Malato EC Fumarasi EC Citrato sintasi EC GTP uccinato GDP + Pi uccinato EC C 2 uccinil sintetasi EC uccinil α-chetoglutarato EC Isocitrato EC EC EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 48

49 uccinil sintetasi (EC ) 2 GTP GDP + Pi 2 + C 2 Fumarasi EC uccinato EC uccinato uccinil sintetasi EC uccinil + C 3 3 C Converte il succinil- in Malato succinato Citrato sintasi e produce GTP (ATP) EC EC da GDP (ADP) e Pi. L enzima è fosforilato in una is. 2 È un eterodimero: EC α-chetoglutarato EC di fosforilazione (is) e lega C 2 La subunità α contiene il sito. EC La subunità β dà la specificità per ATP o GTP. Isocitrato EC ( G =-2.9 kj/mol). La reazione è vicina all equilibrio + C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Meccanismo uccinil + + P uccinato P P : + Enzima Enzima P P P P P GTP 2 GDP 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 49

50 uccinil sintetasi (EC ) ubunità β ito di Fosforilazione (fosfoistidina) ubunità α v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III uccinil sintetasi (EC ) Mitocondriale 2fp4 Citosolica 1cqi v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 50

51 uccinato (EC ) + C 2 2 Malato EC Fumarasi EC C 3 Citrato sintasi EC C 2 Fumarato uccinato EC uccinato uccinil sintetasi EC EC EC GTP GDP + Pi + α-chetoglutarato EC C 2 Isocitrato EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III uccinato (EC ) Per completare il ciclo il succinato deve venire convertito in ossalacetato. Il succinato è deidrogenato a fumarato stereospecificatamente dalla flavoproteina succinato con produzione di 2. La succinato è il solo enzima di membrana del ciclo di Krebs. Gli elettroni passano dal succinato al, che è legato covalentemente alla proteina attraverso un residuo di is. Il 2 è riossidato a dal Coenzima Q nella catena di trasporto degli elettroni. Il malonato, strutturalmente analogo al succinato, è un forte inibitore competitivo e blocca il ciclo. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III uccinato Malonato gsartor 51

52 uccinato (EC ) 1nek v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Fumarasi (EC ) + C 2 2 Fumarasi EC Malato Malato EC C 3 Citrato sintasi EC C 2 Fumarato uccinato EC uccinil sintetasi EC EC EC GTP GDP + Pi + α-chetoglutarato EC C 2 Isocitrato EC C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 52

53 Fumarasi (EC ) + C 2 2 Fumarasi EC Malato Malato EC C 3 Citrato sintasi EC C Fumarato 2 2 uccinato EC EC La fumarasi catalizza l idratazione reversibile del uccinil sintetasi EC EC fumarato, si forma ()-malato (L-malato). GTP α-chetoglutarato È una reazione stereospecifica, viene idratato il GDP + Pi Isocitrato EC doppio legame trans C 2 ma non EC il cis (maleato). + + dell enzima non l isomero D. ella reazione inversa solo il L-malato è substrato C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Fumarato Meccanismo + Carbanione C + - -Malato C + Carbocatione v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 53

54 Fumarasi (EC ) 1fuo v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Malato (EC ) + C 3 3 C 2 ssalacetato Citrato sintasi EC Malato Malato Fumarasi EC EC uccinato EC rigenerando il composto EC di partenza del ciclo e La L-malato ossida il malato a ossalacetato producendo AD. uccinil sintetasi La reazione è sfavorita EC ( G = 29.7 kj/mol), EC ma 2 la concentrazione di ossalacetato è bassa (<10-6 M), il che GTP α-chetoglutarato GDP + Pi spinge la reazione Isocitrato EC in avanti. EC Inoltre la reazione C 2 successiva catalizzata dalla citrato sintasi è altamente favorita ( G = AD kj/mole) e + + sottrae ulteriormente + AD l ossalacetato + dal mezzo. C 2 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 54

55 Malato (EC ) Mitocondriale 1mld Citosolica 5mdh v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Energia 40 G ' (kj/mol) Citrato sintasi Isocitrato α-chetoglutarato uccinil- sintasi uccinato Fumarasi Malato eazione v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 55

56 Energia PITIV G (kj/mol) 0 Citrato sintasi Isocitrato α-chetoglutarato uccinil- sintasi uccinato Fumarasi Malato EGATIV eazione v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Energia v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 56

57 Ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs è al centro del metabolismo. Le vie degradative (catabolismo) lo alimentano, le vie sintetiche (anabolismo) ne usano i componenti. È una via AFIBLICA, opera infatti sia nel catabolismo che nell anabolismo cellulare. Tutte le reazioni avvengono nella matrice mitocondriale. ei mitocondri vi sono anche gli enzimi della fosforilazione ossidativa e quelli della ossidazione degli acidi grassi e degli aminoacidi. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs 2 C 4 C 4 + C 4 C 2 C 3 C 2 C 6 3 C 2 2 C 4 C 6 2 GTP GDP + Pi C 4 C C C 5 C 6 C 6 + C 1 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 57

58 Ciclo di Krebs 2 C 4 2 C 4 C 4 + C 4 C C 2 C 2 3 C 6 3 C C GTP GDP + Pi C C C C C + 5 C 6 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III C 1 Asp, Phe, Tyr (Asn) AMIACIDI PIIMIDIE GLUC 2 Fumarato C 2 + ssalacetato Malato Acetil C 2 C 3 Citrato 3 C Piruvato CLETEL ACIDI GAI 2 2 uccinato cis-aconitato GTP GDP + Pi PFIIE ACIDI GAI DIPAI Ile, Met, Val PUIE + Glu uccinil C 2 α-chetoglutarato C 2 AMIACIDI ssalosuccinato Isocitrato + 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 58

59 Aminoacidi ssalacetato Acetil- Ciclo di Krebs Citrato Citrato sintasi Citrato Citrato ATP-citrato liasi ssalacetato AD Acetil- AD Malato C 2 Malato Malato Malato Malato ADP + ADP + Pi Piruvato carbossilasi ATP AD Piruvato ADP + Pi Piruvato carbossilasi ATP C 2 Enzima malico ADP C 2 Piruvato C 2 Piruvato Piruvato MATICE MITCDIALE AD LAT CITPLAMA Glucosio Glicolisi v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III eazioni anaplerotiche Gli intermedi del ciclo di Krebs sono risintetizzati dalle reazioni anaplerotiche. La concentrazione degli intermedi nel ciclo rimane pressoché costante. La principale reazione anaplerotica è quella che porta alla produzione di ossalacetato da C 2 e piruvato. La reazione è catalizzata dalla piruvato carbossilasi. La produzione di ossalacetato avviene principalmente nel rene e nel fegato. La piruvato carbossilasi è fortemente stimolata da acetil-. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 59

60 Ci sono prove che suggeriscono la formazione di complessi multienzimatici per il ciclo di Krebs. Ciò potrebbe facilitare la canalizzazione dei substrati tra i siti attivi. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Controllo I fattori che controllano il flusso del ciclo sono: Disponibilità dei substrati Inibizione da prodotti Inibizione allosterica nei primi passaggi La citrato sintasi, la isocitrato e la α-chetoglutarato possono essere tutti punti di regolazione: La disponibilità di acetil- e ossalacetato regolano l attività della citrato sintasi. L accumulo di AD inibisce le due. L accumulo di prodotto inibisce gli altri passaggi. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 60

61 Controllo L inibizione della citrato sintasi da ATP è eliminata da ADP. ei muscoli di vertebrato lo ione Ca ++ attiva la isocitrato e la α-chetoglutarato. Le velocità della glicolisi e del ciclo di Krebs sono integrate. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Controllo + 2 ssalacetato Malato Fumarato Acetil C 3 C 2 3 C Piruvato Citrato 2 2 uccinato AD cis-aconitato ATP ATP GTP GDP + Pi + uccinil C 2 AD + α-chetoglutarato C 2 Ca ++ ssalosuccinato Isocitrato + 2 ADP v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 61

62 Varianti al ciclo di Krebs Mancanza di enzimi C 2 In alcuni microrganismi il ciclo di Krebs serve per produrre intermedi e non energia. Manca la α-chetoglutarato. 2 + ssalacetato Malato Acetil C 2 C 3 Citrato 3 C Piruvato Fumarato 2 2 uccinato cis-aconitato 2 ATP ucleotidi Aminoacidi Porfirine GTP GDP + Pi uccinil α-chetoglutarato ssalosuccinato Isocitrato + C v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 62

63 Ciclo del gliossilato + Acetil C 3 ssalacetato Malato Citrato Acetil C 3 2 uccinato Gliossilato cis-aconitato 2 Isocitrato In alcuni organismi (piante, microrganismi ) vi è la conversione di acetato (acetil-) a carboidrati attraverso il ciclo del gliossilato. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo del gliossilato e ciclo di Krebs + Acetil C 2 2 C 3 3 C Piruvato ssalacetato Malato Citrato Fumarato Acetil C uccinato Gliossilato cis-aconitato uccinil GTP GDP + Pi α-chetoglutarato C 2 + ssalosuccinato Isocitrato + 2 C 2 v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 63

64 Da grassi a zuccheri ei semi in germinazione avviene la conversione di acidi grassi in glucosio. Ciò avviene in tre compartimenti diversi: I vacuoli lipidici, dove i grassi vengono idrolizzati in acidi grassi e glicerolo I gliossisomi, dove gli acidi grassi vengono β-ossidati a Aceil e si forma succinato dal ciclo del gliossilato ei mitocondri dove il succinato entra per formare malato che va formare carboidrati. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Da grassi a zuccheri ei semi in germinazione avviene la conversione di acidi grassi in glucosio. Ciò avviene in tre compartimenti diversi: I vacuoli lipidici, dove i grassi vengono idrolizzati in acidi grassi e glicerolo I gliossisomi, dove gli acidi grassi vengono β-ossidati a Aceil e si forma succinato dal ciclo del gliossilato ei mitocondri dove il succinato entra per formare malato che va formare carboidrati. Triacilgliceroli Vacuolo lipidico Acidi grassi Acidi grassi Acetil ssalacetato Malato Citrato Ciclo del Gliossilato Acetil Isocitrato Gliossilato uccinato Gliossisoma EI Gluconeogenesi ssalacetato Malato Fumarato Malato Ciclo di Krebs ssalacetato uccinato Citrato Mitocondrio v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 64

65 pazio extracellulare Ciclo di Krebs nel Plasmodium falciparum Parassita Malato + Acetil C 2 Acetil PEP Glucoso 2 C 3 3 C Piruvato Glicolisi Malato ssalacetato Acetilazione degli istoni Glucoso Citrato Fumarato 2 Acetil 2 uccinato cis-aconitato 2 Digestione dell'emoglobina intesi dell'eme GTP GDP + Pi Glutamato + uccinil C 2 α-chetoglutarato ssalosuccinato Isocitrato + Globulo rosso Glutamato C 2 Glutamina Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum Kellen L. lszewski, Michael W. Mather, Joanne M. Morrisey, Benjamin A. Garcia, Akhil B. Vaidya, Joshua D. abinowitz, Manuel Llina ATUE, Vol 466, 5 August 2010, pp v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III pazio extracellulare Ciclo di Krebs nel Plasmodium falciparum Parassita Malato + Acetil C 2 Acetil PEP Glucoso 2 C 3 3 C Piruvato Glicolisi Malato ssalacetato Acetilazione degli istoni Glucoso Citrato Fumarato 2 Acetil 2 Via uccinato ossidativa cis-aconitato Via riduttiva 2 Digestione dell'emoglobina intesi dell'eme GTP GDP + Pi Glutamato + uccinil C 2 α-chetoglutarato ssalosuccinato Isocitrato + Globulo rosso Glutamato C 2 Glutamina Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum Kellen L. lszewski, Michael W. Mather, Joanne M. Morrisey, Benjamin A. Garcia, Akhil B. Vaidya, Joshua D. abinowitz, Manuel Llina ATUE, Vol 466, 5 August 2010, pp v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 65

66 Ciclo di Krebs nel Plasmodium falciparum Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum Kellen L. lszewski, Michael W. Mather, Joanne M. Morrisey, Benjamin A. Garcia, Akhil B. Vaidya, Joshua D. abinowitz, Manuel Llina ATUE, Vol 466, 5 August 2010, pp v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Ciclo di Krebs nel Plasmodium falciparum Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum Kellen L. lszewski, Michael W. Mather, Joanne M. Morrisey, Benjamin A. Garcia, Akhil B. Vaidya, Joshua D. abinowitz, Manuel Llina ATUE, Vol 466, 5 August 2010, pp v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III gsartor 66

67 ommario Il piruvato è convertito in acetil e C 2 dalla piruvato (E 1 +E 2 +E 3 ). L acetil è convertito in C 2 attraverso il ciclo di Krebs, si generano: tread, un 2, e ungtp (per fosforilazione a livello del substrato). Gli intermedi del ciclo di Krebs sono anche precursori per la sintesi di altre biomolecole (acidi grassi, steroidi, aminoacidi, porfirine purine, pirimidine e glucoso). L ossalacetato è riformato dal piruvato attraverso la carbossilazione catalizzata dalla piruvato carbossilasi. v gsartor Metabolismo dei carboidrati - III Crediti e autorizzazioni all utilizzo Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CAMPE Pamela, AVEY ichard, FEIE Denise. LE BAI DELLA BICIMICA [IB ] Zanichelli EL David L., CX Michael M. I PICIPI DI BICIMICA DI LEIGE - Zanichelli GAETT eginald., GIAM Charles M. BICIMICA con aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VET Donald, VET Judith G, PATT Charlotte W FDAMETI DI BICIMICA [IB ] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Brenda: Protein Data Bank: ( ensselaer Polytechnic Institute: Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla rlandini dell Università di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: gsartor.org/pro Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l autore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio artor Università di Bologna Giorgio artor Ufficiale: giorgio.sartor@unibo.it Personale: giorgio.sartor@gmail.com Aggiornato il 16/04/ :38:46 gsartor 67