RACCOMANDAZIONI PER L ESECUZIONE DI TEST MOLECOLARI SU BIOPSIA LIQUIDA IN ONCOLOGIA

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1 RACCOMANDAZIONI PER L ESECUZIONE DI TEST MOLECOLARI SU BIOPSIA LIQUIDA IN ONCOLOGIA LUGLIO 2018 Associazione Italiana di Oncologia Medica

2 RACCOMANDAZIONI PER L ESECUZIONE DI TEST MOLECOLARI SU BIOPSIA LIQUIDA IN ONCOLOGIA LUGLIO 2018 Associazione Italiana di Oncologia Medica

3 SOMMARIO 5 Biopsia liquida: definizione 6 Applicazioni cliniche della biopsia liquida 6 L analisi mutazionale dell EGFR al momento della diagnosi in pazienti naïve con NSCLC avanzato 8 L analisi mutazionale del gene EGFR al momento della progressione di malattia a EGFR-TKI in pazienti con NSCLC avanzato 10 Prospettive future: applicazione clinica della biopsia liquida nel tumore del colon retto metastatico 11 Problematiche pre-analitiche: dal prelievo di sangue al cfdna 12 Estrazione, quantificazione e conservazione del cfdna 13 Metodiche per lo studio delle mutazioni nel ctdna 13 PCR Real Time 13 PCR digitale (dpcr) 14 Raccomandazioni per il protocollo di dpcr 15 NGS 17 La refertazione 18 Bibliografia

4 Gruppo di Lavoro AIOM SIAPEC-IAP SIF SIBioC Massimo Barberis (SIAPEC-IAP) Ettore Capoluongo (SIBioC) Lucio Crinò (AIOM) Romano Danesi (SIF) Marzia Del Re (SIF) Stefania Gori (AIOM) Antonio Marchetti (SIAPEC-IAP) Caterina Marchiò (SIAPEC-IAP) Nicola Normanno (AIOM) Carmine Pinto (AIOM) Antonio Russo (AIOM) Anna Sapino (SIAPEC-IAP) Andrea Sartore Bianchi (AIOM) Mauro Truini (SIAPEC-IAP) Tiziana Venesio (SIAPEC-IAP)

5 5 BIOPSIA LIQUIDA: DEFINIZIONE Con il termine di biopsia liquida si fa riferimento all utilizzo di fluidi biologici come surrogato del tessuto neoplastico per ottenere informazioni utili a fini diagnostici, prognostici o per predire la risposta alla terapia con specifici farmaci antitumorali. L analisi del DNA tumorale circolante (circulating tumor DNA, ctdna) contenuto nel DNA libero circolante (cell free DNA, cfdna) che può essere isolato dal sangue periferico, rappresenta ad oggi il principale approccio di biopsia liquida impiegato nella pratica clinica. Tuttavia, è possibile che nel futuro altri derivati del sangue, quali le cellule tumorali circolanti, l RNA circolante ed i microrna (mirna), le piastrine, gli esosomi, come pure altri fluidi biologici quali le urine e il liquido cefalorachidiano, possano essere utilizzati nella pratica clinica per avere ulteriori informazioni rispetto a quelle ottenibili mediante l analisi del ctdna. La quota di cf/ctdna può risultare variabile sia dal punto di vista del momento di raccolta del campione che dalla condizione clinica del paziente. Nell attuale pratica clinica, l analisi della biopsia liquida è generalmente riferita all identificazione di mutazioni driver presenti nel ctdna derivanti sia dal tumore che dalle cellule tumorali circolanti. Il ctdna è tuttavia una frazione, a volte estremamente esigua, del cfdna totale che è possibile isolare dal plasma dei pazienti neoplastici e che contiene anche DNA derivante da cellule non-trasformate. Alcuni sistemi commerciali (con marchio CE-IVD) reperibili sul mercato europeo ed italiano riportano come target il ctdna mentre altri il cfdna, dato che quando si effettua l analisi non si ha certezza della presenza di DNA di origine tumorale fino all eventuale rilevazione di una mutazione. Per questo motivo, nel presente documento si farà riferimento al cfdna più in generale, ed al ctdna in caso di positività per le mutazioni oggetto dell analisi. La biopsia liquida presenta alcuni evidenti vantaggi rispetto a quella tradizionale effettuata sul tessuto, ovvero: la procedura non è invasiva, in quanto si tratta di un semplice prelievo di sangue pressoché privo di complicanze; può essere ripetuta nel tempo per monitorare l evoluzione molecolare della malattia, sebbene non esista ad oggi evidenza che indirizzi a

6 modificare la scelta terapeutica, in assenza di progressione clinica di malattia; è in grado di rappresentare in maniera più esaustiva rispetto alla biopsia tissutale l eterogeneità molecolare della malattia contenendo, almeno potenzialmente, DNA tumorale derivante dalle diverse aree di uno stesso tumore e dalle possibili sedi di malattia. La biopsia liquida presenta però anche alcuni limiti: la quantità di ctdna nel contesto del cfdna è spesso estremamente limitata, in funzione sia del volume che delle localizzazioni di malattia, e ciò può risultare in falsi negativi; in presenza di eterogeneità tumorale, la biopsia liquida fornisce scarse informazioni sulla rappresentatività nel contesto del tumore del biomarcatore individuato. APPLICAZIONI CLINICHE DELLA BIOPSIA LIQUIDA Il principale campo di applicazione della biopsia liquida ad oggi è rappresentato dall identificazione di fattori predittivi in pazienti con malattia avanzata. Tuttavia, è possibile che nel prossimo futuro queste indicazioni vengano estese, con particolare riguardo all identificazione della malattia minima residua in pazienti sottoposti ad intervento chirurgico radicale. Per quest ultima applicazione sono però necessari ulteriori studi e miglioramenti tecnici e di standardizzazione, prima che essa possa essere direttamente importata nella pratica clinica. La biopsia liquida è al momento principalmente utilizzata per l analisi mutazionale del gene dell epidermal growth factor receptor (EGFR) in pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (non-small cell lung cancer, NSCLC) in stadio avanzato. In particolare, esistono due diversi scenari in cui il test EGFR su biopsia liquida trova attuale indicazione L analisi mutazionale dell EGFR al momento della diagnosi in pazienti naïve con NSCLC avanzato La determinazione dello stato mutazionale del gene EGFR su campione tissutale/citologico ottenuto mediante biopsia o intervento chirurgico al momento della diagnosi è attualmente raccomandata in tutti i pazienti con NSCLC, stadio IIIB-C e IV, ad eccezione dei pazienti fumatori con istotipo squamoso, per la scelta della migliore strategia terapeutica (consultare Linee Guida AIOM Tumori toracici ). Tuttavia, dati recenti suggeriscono che circa il 25% delle biopsie polmonari standard non riesca a fornire una quantità/qualità di materiale adeguato all analisi molecolare. Molteplici studi e meta-analisi hanno valutato l accuratezza diagnostica dell analisi del ctdna per l identificazione delle più frequenti mutazioni

7 Pazienti naïve (NSCLC avanzato) Test EGFR MS* Campione tissutale/ citologico EGFR MS*- positivo EGFR MS*- negativo Campione tissutale/ citologico non adeguato Test EGFR MS* ctdna EGFR MS*- positivo EGFR MS*- negativo *Mutazione Sensibilizzante 7 FIGURA 1. Algoritmo del test EGFR in pazienti naïve con NSCLC avanzato attivanti del gene EGFR (delezioni esone 19, L858R dell esone 21) in pazienti naïve con NSCLC avanzato. Nel complesso questi studi hanno dimostrato una buona specificità del test EGFR su plasma, in genere superiore al 90%. La sensibilità risulta invece essere inferiore, con oscillazioni tra il 50% e l 80% in funzione della tecnologia impiegata. > Sulla base di tali evidenze la valutazione dello stato mutazionale del gene EGFR su biopsia liquida è attualmente raccomandata come possibile alternativa all analisi su tessuto tumorale nei pazienti con nuova diagnosi di NSCLC avanzato in cui la quantità e/o qualità del tessuto disponibile non siano sufficienti per effettuare le analisi molecolari previste. Per indicazioni terapeutiche consultare le Linee Guida AIOM Tumori Toracici.

8 2. L analisi mutazionale del gene EGFR al momento della progressione di malattia a EGFR-TKI in pazienti con NSCLC avanzato La recente approvazione ed ammissione a rimborsabilità da parte di AIFA del primo inibitore di terza generazione di EGFR (Determina AIFA GU n.184 dell 8/08/2017), per il trattamento di pazienti con NSCLC localmente avanzato o metastatico positivo per la mutazione T790M, rende necessaria la rivalutazione dello stato mutazionale del gene EGFR al momento della progressione radiologica dopo trattamento con un EGFR-TKI, in modo tale da definire la migliore strategia terapeutica. I risultati dello studio AURA hanno dimostrato come la progressione libera da malattia dei pazienti stratificati per la presenza della mutazione T790M in base al test eseguito su tessuto oppure su biopsia liquida sia sovrapponibile, confermando quindi la possibilità di utilizzo del test su ctdna. Va comunque considerato che la sensibilità e la specificità del test per la T790M appaiono in generale inferiori rispetto alle mutazioni sensibilizzanti dell EGFR. T790M - positivo EGFR MS* - positivo Pazienti EGFR+ PD a EGFR-TKI Test ctdna EGFR-T790M EGFR MS* T790M - negativo/positivo EGFR MS* - negativo (test non informativo) T790M - negativo EGFR MS* - positivo 8 Test EGFR-790M campione tissutale *Mutazione Sensibilizzante T790M - positivo T790M - negativo FIGURA 2. Algoritmo del test EGFR in pazienti con NSCLC avanzato in progressione dopo EGFR-TKI > Data la sua non-invasività e rapidità di esecuzione, il test T790M mediante biopsia liquida è attualmente impiegato in diversi centri come primo approccio diagnostico in tutti i pazienti con NSCLC avanzato EGFR-positivo in progressione dopo trattamento con EGFR-TKI. Tuttavia, a causa del rischio di falsi negativi associati a tale metodica, tutti i pazienti nei quali l analisi mutazionale su cfdna risulti negativa devono essere sottoposti ad

9 analisi mutazionale su tessuto tumorale prelevato mediante re-biopsia, in modo tale da definire la migliore strategia terapeutica. Prima di procedere alla biopsia tessutale, si può eventualmente prendere in considerazione la ripetizione della biopsia liquida. Per indicazioni terapeutiche consultare le Linee Guida AIOM Tumori Toracici. Per garantire una migliore interpretazione del test, oltre alla T790M deve essere anche eseguita la valutazione della mutazione sensibilizzante di origine. In caso di assenza di tale mutazione, il test dovrà essere considerato non-informativo in quanto il prelievo non contiene quantità sufficienti di ctdna. A tale riguardo, molteplici studi, e una recente meta-analisi, hanno chiaramente evidenziato come la sede delle metastasi tumorali influenzi in modo significativo l accuratezza diagnostica dell analisi mutazionale del gene EGFR eseguita su ctdna. La sensibilità di tale metodica nella determinazione sia delle mutazioni attivanti che della mutazione di resistenza T790M del gene EGFR può infatti variare dall 80% in presenza di metastasi extra-toraciche al 50% in presenza di localizzazioni esclusivamente intra-toraciche. 9 TABELLA 1. NSCLC avanzato: interpretazione del risultato del test EGFR su biopsia liquida in pazienti in progressione dopo EGFR TKI Mutazione EGFR sensibilizzante T790M Interpretazione + + T790M positivo + T790M negativo. La biopsia tessutale è raccomandata. + T790M positivo. L analisi deve essere ripetuta per escludere possibili falsi positivi. Campione non informativo. I livelli di ctdna sono troppo bassi. Ripetere prelievo o procedere alla biopsia tessutale. Al fine di incrementare le possibilità di successo della biopsia liquida, il test dovrebbe essere eseguito al momento dell evidente progressione di malattia, quando sono maggiori le possibilità che il DNA tumorale sia rilasciato nella circolazione. Infine, non esistono ad oggi evidenze da studi prospettici sull opportunità di interrompere il trattamento con EGFR TKI in caso di comparsa di mutazione T790M nella biopsia liquida in assenza di progressione di malattia.

10 3. Prospettive future: applicazione clinica della biopsia liquida nel tumore del colon retto metastatico Numerosi studi hanno dimostrato la fattibilità di eseguire il test RAS su biopsia liquida come potenziale sostituto dell analisi su tessuto tumorale nel carcinoma del colon retto (CCR) metastatico. La concordanza tra i due approcci è, negli studi più moderni, 90% e, se da una parte vi è ulteriore margine di miglioramento in termini di sensibilità, dall altra bisogna tenere conto che: a. il tumore e il sangue periferico sono due tessuti distinti e pertanto non è ragionevole attendersi una concordanza perfetta; b. le discrepanze osservate in termini di specificità assumendo il tessuto tumorale come riferimento trovano giustificazione nel fatto che la biopsia liquida è in grado di superare l eterogeneità spaziale e temporale che limitano l analisi tissutale. Inoltre, la biopsia liquida offre i vantaggi di un approccio relativamente non invasivo e più duttile, sia per la possibilità di effettuare più facilmente la determinazione dello stato mutazionale in base al momento esatto dell intervento terapeutico con anti-egfr, sia per il ridotto turnaround time. Tuttavia, alcune importanti considerazioni limitano l importazione tout court della biopsia liquida nella clinica quale sostituto per l analisi mutazionale di RAS nel carcinoma del colon-retto ai fini dell esclusione dalla terapia con cetuximab e panitumumab. In primo luogo, risulta difficile l interpretazione dei risultati negativi del test che potrebbero essere condizionati dai livelli di ctdna e dalla sensibilità delle metodiche ed essere quindi falsi negativi. Inoltre, quest analisi non è ancora controllata da programmi di controllo di qualità esterna (EQA schemes) quali quelli messi in atto per l analisi tissutale. Infine, non esistono sufficienti evidenze cliniche per stabilire in termini quantitativi quale sia la soglia percentuale di alleli RAS mutati determinata su sangue periferico che conferisca resistenza alla terapia con anti-egfr, visto che la conoscenza attuale si basa su analisi svolte su tessuto tumorale. Pertanto, l analisi dello stato di RAS del tumore per la scelta terapeutica deve essere effettuata come gold standard sul tessuto tumorale in tutti i casi in cui questo sia possibile e vicariata dall analisi mediante biopsia liquida solo nei rari casi di tessuto insufficiente/inaccessibile. Infine, per quanto riguarda l impiego della biopsia liquida per monitorare la risposta a farmaci anti-egfr, questa deve essere oggi considerata unicamente come indagine di ricerca e non trova attuale applicazione nella pratica clinica. 10

11 11 PROBLEMATICHE PRE-ANALITICHE: DAL PRELIEVO DI SANGUE AL cfdna Il cfdna può essere estratto da diversi liquidi biologici. Tuttavia, le procedure maggiormente standardizzate nella pratica clinica riguardano l isolamento del cfdna dal sangue periferico. La quantità di DNA che è possibile estrarre dal sangue periferico è spesso molto limitata, nella misura di pochi ng/ml, di cui il ctdna è solo una frazione. Infatti, la concentrazione del DNA target nel plasma dipende da diversi fattori, tra cui: il carico di malattia, i livelli di espressione della mutazione nelle cellule del tumore primitivo, la velocità di rilascio del ctdna nel torrente circolatorio e i livelli di DNA rilasciati da cellule non trasformate (ad esempio, in conseguenza di processi infiammatori che si instaurano nel tessuto sano e che circonda il tumore o di lisi dei leucociti dopo il prelievo di sangue). Per questi motivi la fase pre-analitica deve essere attentamente controllata. Un primo problema che può inficiare la qualità del campione è costituito dall emolisi che può generarsi durante la flebotomia: è necessario, pertanto, che il prelievo di sangue sia effettuato da personale altamente qualificato. Il cfdna può essere isolato dal siero o dal plasma. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che l uso del plasma è da preferirsi al siero; in quest ultimo, infatti, il processo di coagulazione causa il rilascio di DNA genomico derivante dai leucociti. Non esistono al momento indicazioni conclusive sulla quantità di sangue da impiegare ai fini diagnostici ed in routine di laboratorio. Tuttavia, molti kit diagnostici indicano la quantità minima di plasma necessaria per l analisi. Il prelievo può essere raccolto in tubi standard K2- o K3-EDTA oppure impiegando tubi contenenti speciali fissativi, in grado di stabilizzare il sangue e il cfdna per diversi giorni. Se il prelievo è effettuato impiegando tubi standard, si deve tenere conto di due fattori importanti: 1. il cfdna ha una breve emivita, stimata in circa 2,5 ore; 2. diversi studi hanno dimostrato che superate le tre ore dal prelievo si può verificare una lisi dei leucociti con conseguente rilascio di DNA germinale che determina una diluizione del DNA tumorale. Pertanto, il sangue raccolto in tubi contenenti solo EDTA può essere conservato prima dell isolamento del plasma per un massimo di 3 ore a temperatura ambiente. La conservazione del sangue alla temperatura di 4 C non previene la lisi dei leucociti. Nei casi in cui non sia possibile processare il campione entro le 3 ore dal prelievo, si raccomanda l utilizzo di tubi contenenti specifici conservanti in grado di stabilizzare sia il cfdna che i leucociti. Tuttavia, questi tubi garantiscono, in genere, la conservazione del prelievo solo in un range limitato di temperatura (16-24 C). Pertanto, è importante assicurarsi che

12 queste temperature siano rispettate in caso di trasporto del campione. Per l eliminazione dei residui cellulari e per ottenere un campione idoneo alle successive analisi, il plasma deve essere isolato mediante centrifugazione, assicurandosi di aver completamente allontanato il contaminante leucocitario derivante dal buffy coat. Esistono diversi protocolli di centrifugazione. È consigliabile eseguire una prima centrifugazione a bassa velocità ( g) per evitare la lisi dei leucociti ed una successiva centrifugazione del sopranatante ad elevata velocità ( 3000g) per rimuovere tutti i contaminanti. Le centrifugazioni devono essere eseguite senza freno. È suggerito anche l impiego di una centrifuga refrigerata (4 C). Il plasma ottenuto può essere conservato a -20 C per brevi periodi (~ 1 mese) o, per periodi più prolungati, a -80 C, temperatura che garantisce una maggiore stabilità del DNA. Tuttavia, all aumentare del periodo di conservazione diminuisce la quantità totale di cfdna che è possibile estrarre, soprattutto se il campione dovesse essere sottoposto a cicli di congelamento e scongelamento. ESTRAZIONE, QUANTIFICAZIONE E CONSERVAZIONE DEL cfdna Esistono molti metodi per l estrazione del cfdna, che comprendono sia l utilizzo di kit commerciali che di protocolli sviluppati dai laboratori. A causa della piccola quantità e della natura molto frammentata del cfdna nel plasma (<1.000 bp), non dovrebbero essere utilizzate metodiche di estrazione validate su campioni tissutali o su altre matrici biologiche. Il metodo di estrazione deve essere molto affidabile e deve generare quanto più DNA possibile del campione in esame, per non compromettere il risultato dell analisi e generare risultati falsi negativi o positivi. Per l estrazione e la purificazione del cfdna da plasma sono oggi disponibili vari kit commerciali dedicati a questo specifico uso. Questi kit sono in genere basati sull utilizzo di colonnine dotate di membrane di silice, in associazione con pompa a vuoto, oppure sull impiego di biglie magnetiche, per la cattura degli acidi nucleici. Questi sistemi sono corredati da protocolli di semplice esecuzione e permettono di estrarre da 1 a 24 campioni, freschi o congelati, simultaneamente, e catturare frammenti di cfdna da plasma a partire da un minimo di 10 µl a un massimo di 10 ml di campione. In generale, si ritiene che 2 ml di plasma sia la quantità minima necessaria in grado di fornire risultati accurati utilizzando le diverse metodiche di estrazione. Inoltre, la maggior parte dei kit sopra citati contiene reagenti o, in generale, dispositivi, in grado di concentrare l eluato in un volume flessibile di eluizione ( µl). Una volta estratto, il cfdna deve essere sottoposto a quantificazione, in modo da ottimizzare il processo di amplificazione e di conoscere se le successive analisi molecolari possono essere possibili a partire dal cfdna 12

13 estratto. L accuratezza nella fase di quantificazione può essere ottenuta con sistemi di elettroforesi capillare oppure fluorimetrici. In generale, i kit di estrazione sopra citati consentono di ottenere campioni di cfdna di alta qualità e con una concentrazione superiore a 5 ng/ml. La quantità di DNA estratto è comunque influenzata dallo stato di malattia e dal momento del prelievo. La conservazione ottimale del cfdna ne consente un utilizzo anche a distanza di tempo per poter eseguire ulteriori indagini molecolari, previo esplicito consenso informato da parte del paziente. Il processo richiede una strumentazione adeguata, tra cui congelatori a -20 C/-80 C, dispositivi di controllo grafico della temperatura, sistemi di allarme acustico, controlli di qualità del materiale biologico conservato. 13 METODICHE PER LO STUDIO DELLE MUTAZIONI NEL ctdna PCR Real Time L analisi di mutazioni puntiformi oppure di piccole inserzioni/delezioni su ctdna può essere condotta tramite utilizzo di tecnologie di Real Time PCR, spesso modificate per incrementare la sensibilità del test. Ad esempio, esistono in commercio kit per ctdna basati sulla tecnologia Amplification Refractory Mutation System (ARMS)/SCORPION che rilevano le mutazioni a carico degli esoni 19, 20 e 21 di EGFR. Questi kit permettono la co-amplificazione di uno o più alleli mutati e di un gene di controllo endogeno. Inoltre, una specifica miscela di oligonucleotidi di controllo consente la valutazione della qualità e quantità del DNA presente nei campioni. L analisi con questi kit permette di rilevare basse percentuali di allele mutato in presenza di elevate quantità di DNA genomico wild-type mediante amplificazione con sonde sequenza-specifiche marcate con FAM ed HEX, che possono raggiungere un limite di rilevazione (LOD) anche inferiore allo 0,5%, con differenze tra le varie mutazioni identificate. PCR digitale (dpcr) La PCR digitale (dpcr) è un evoluzione di ultima generazione della PCR di cui esistono due piattaforme tecnologiche: 1) droplet digital PCR - ddpcr e 2) BEAMing (Beam, Emulsion, Amplification, Magnetics) dpcr. Entrambe le metodiche si basano sulla ripartizione del campione in migliaia di droplets (goccioline) omogenee in un emulsione olioacqua; la successiva amplificazione dell emulsione contenente il DNA permette la discriminazione del DNA target grazie all uso di sonde fluorescenti. Queste caratteristiche sono di grande rilevanza nell ambito dell analisi del ctdna, laddove è necessario ricercare ed amplificare rare molecole di DNA tumorale in presenza di un grande eccesso di DNA germinale wildtype. Infatti, la ripartizione del campione in goccioline ha la funzione di

14 ridurre la competizione tra il DNA mutato tumorale e il DNA wild-type, aumentando la specificità e la sensibilità dell analisi. In questo modo l abbondanza relativa del DNA target mutato rispetto al wild-type viene aumentata. La quantità di DNA richiesta per l amplificazione in digital PCR è di 3 ng (con un range di 50 fg-100 ng) e di 3-30 ng per la BEAMing dpcr. La ddpcr è caratterizzata da un unica fase di amplificazione del DNA target, che avviene all interno di circa droplets, uguali per dimensione e volume, formatesi dall emulsione olio-acqua, e dall elaborazione finale dei dati tramite la statistica di Poisson. La BEAMing dpcr, invece, prevede una fase di pre-amplificazione del cfdna utilizzando PCR convenzionale per amplificare il target di interesse; successivamente i prodotti di amplificazione generati vengono ripartiti in migliaia di goccioline omogenee in un emulsione olio-acqua con aggiunta di microsfere magnetiche a cui i prodotti di PCR restano fisicamente legati per poi essere facilmente separati usando un magnete. L elaborazione finale dei dati avviene tramite citometria a flusso. Esistono in commercio saggi per la determinazione delle mutazioni a carico degli esoni di EGFR mediante le tecniche di dpcr. La sensibilità e la specificità dei test con ddpcr e BEAMing dpcr sono, rispettivamente, dello 0,1% e dello 0,01%. Seppur l approccio con BEAMing dpcr sembrerebbe avere sensibilità più elevata, in letteratura è frequentemente riportata una specificità più bassa rispetto alla ddpcr (87% vs 97%, rispettivamente). 14 Raccomandazioni per il protocollo di dpcr > Le reazioni dpcr devono essere allestite sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello utilizzato per la fase di estrazione del cfdna e dell analisi dei prodotti di amplificazione, usando opportune precauzioni per evitare contaminazioni (camice dedicato, guanti, puntali con filtro, ecc.). In ogni caso, va predisposta un area dedicata alle procedure di preparazione in dpcr. > L esecuzione della ddpcr prevede un primo step in cui si prepara la soluzione contenente il DNA, la master mix e le sonde. Questa soluzione viene poi trasferita in un apposita cartuccia, all interno della quale viene dispensato l olio per formare l emulsione. La cartuccia viene poi introdotta nell apposito droplet generator a formare le gocce contenute nell emulsione olio-acqua. Il passaggio successivo prevede il trasferimento dell emulsione dalla cartuccia alla piastra da 96 pozzetti, per procedere poi con la reazione di amplificazione.

15 > Per ogni analisi devono essere previsti un controllo positivo di amplificazione (ad esempio, utilizzando un campione di cfdna precedentemente validato) e un controllo negativo (ossia, la miscela di reazione priva di templato di DNA). > Ogni laboratorio dovrebbe validare la metodica di dpcr in via preventiva utilizzando diluizioni di DNA mutato in DNA non-mutato da linee cellulari il cui stato mutazionale di EGFR sia noto. In alternativa, si può ricorrere a campioni di riferimento certificati che garantiscono una corretta determinazione di sensibilità, specificità e LOD. > L analisi dei risultati avviene grazie all uso di un lettore connesso a un computer in cui uno specifico software è in grado di trasformare il segnale da analogico a digitale e rilevare le goccioline negative (prive del DNA target e/o del DNA di riferimento) e positive (che contengono l allele target) in ciascun campione grazie alle varie fluorescenze rilevate. 15 Nella ddpcr, le goccioline negative e quelle positive, vengono contate singolarmente e la frazione di goccioline positive in un campione determina la concentrazione del DNA target espresso in copie/μl. Il software di analisi è in grado di dare informazioni riguardo al numero totale di goccioline generate (per una buona reazione queste dovrebbero essere non inferiori a ) considerando il numero di gocce positive per la mutazione e positive per l allele wild type. I risultati possono essere elaborati a fornire la concentrazione della mutazione come copie/ml, frazione allelica, rapporto tra gli alleli e fractional abundance. Infine, fattori come etanolo o paraffina (come quella utilizzata in alcuni tubi per preservare la lisi cellulare) possono interferire con la formazione dell emulsione rendendo l analisi non valutabile. NGS Le nuove metodologie di sequenziamento definite come next generation sequencing sono caratterizzate da un enorme produttività che varia da poche giga-basi per i sequenziatori da banco, a gb per i sequenziatori di maggiori dimensioni. Con NGS è possibile sequenziare simultaneamente milioni di differenti molecole di DNA potendo individuare in una singola analisi mutazioni, variazioni del numero di copie geniche, fusioni e espressione genica. Inoltre, la sua flessibilità consente di valutare simultaneamente pannelli di geni (da poche unità a centinaia), l intero esoma umano (circa 30 mb), l intero genoma (circa 3,3 gb) o l intero trascrittoma.

16 La marcatura con barcode molecolari permette il sequenziamento contemporaneo di campioni provenienti da diversi pazienti. L impiego di pannelli di NGS consente una migliore interpretazione di indagini eventualmente negative per mutazioni driver di interesse. Infatti, l individuazione di almeno una variante genica nella biopsia liquida rappresenta la prova della presenza di ctdna e consente di refertare con maggiore sicurezza un risultato negativo per la mutazione di interesse. Le due tecnologie con maggiore diffusione sono prodotte da Illumina (San Diego, CA, USA) e da Thermofisher (Ion Torrent, Waltham, MA, USA). La prima prevede la fissazione e l amplificazione clonale in situ delle molecole di DNA su sottile supporto vitreo. Nella seconda il DNA è separato e amplificato in gocciole lipidiche e quindi distribuito in pozzetti microscopici al fondo dei quali vi è un sottile chip semiconduttore. In entrambi i casi il pool delle singole molecole di DNA da sequenziare è chiamato library. La library è generata da amplificazione selettiva delle regioni target con reazioni PCR multiple oppure con la tecnologia hybrid capture con DNA baits (esche). L uso della NGS per la biopsia liquida richiede modifiche dei protocolli normalmente usati per analisi su sangue e tessuti. Il tasso di errore dell NGS varia da 0,1 a 1% quindi, ad esempio, una mutazione con una frequenza allelica sotto tale soglia non può essere differenziata dal cosiddetto rumore di fondo. I protocolli operativi dedicati alla biopsia liquida riducono il tasso di errore. Un esempio classico di tale modifica è l incorporamento di uno specifico identificatore molecolare prima della fase di amplificazione del DNA. Sono state sviluppate tecniche ultrasensibili di NGS dedicate all analisi del ctdna. Il Cancer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq) ha come elemento caratterizzante un selettore che identifica diverse classi di mutazioni somatiche con sensibilità e specificità superiori al 90%. Risultati simili in termini di sensibilità e specificità sono stati raggiunti con le tecniche Tagged-amplicon deep sequencing (Tam-Seq) e Safe-Sequencing System (Safe-SeqS). 16 In conclusione, la tecnica NGS per lo studio del ctdna per quanto sensibile e specifica è ancora molto costosa e richiede un flusso di lavoro complesso da parte di personale altamente specializzato. L uso in clinica di pannelli multigene su questa matrice biologica richiede, inoltre, l uso di software sofisticati e, talora, l ausilio di bioinformatici. È quindi evidente che la scelta tra le diverse tecnologie deve tenere conto della loro sostenibilità e dell uso clinico richiesto nel contesto in cui si opera.

17 LA REFERTAZIONE La refertazione è parte integrante della procedura diagnostica e dovrebbe contenere le seguenti informazioni: L identificazione del paziente L identificazione del medico e della struttura che ha richiesto l analisi. Il materiale utilizzato per l analisi (tipologia, volume) Il momento del prelievo (diagnosi, periodo intra-post chemioterapia o terapia biologica) La data del prelievo del materiale utilizzato per l analisi Le modalità di conservazione del prelievo La data di arrivo del campione nel laboratorio che esegue l analisi La metodica impiegata per l esecuzione dell analisi con indicazione della sensibilità e dei limiti del test Le mutazioni indagate I risultati del test, con specificazione del tipo di mutazione eventualmente rilevata L interpretazione del dato e una valutazione complessiva dell analisi con le eventuali problematiche legate al caso 17 Il referto deve essere compilato su un modello prestabilito, datato e firmato dal responsabile del servizio. In considerazione dell impatto sulla strategia terapeutica, il tempo per la refertazione non deve superare i 5 giorni lavorativi dalla richiesta della determinazione.

18 BIBLIOGRAFIA Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA et al. Phylogenetic ctdna analysis depicts earlystage lung cancer evolution. Nature 2017; 545: Cai X, Janku F, zhan q, et al. Accessing genetic information with liquid biopsies. Trends Genet. 2015;31(10): Chaudhuri AA, Chabon JJ, Lovejoy AF et al. Early Detection of Molecular Residual Disease in Localized Lung Cancer by Circulating Tumor DNA Profiling. Cancer Discov Dec;7(12): El Messaoudi S1, Rolet F, Mouliere F, Thierry AR. Clin Chim Acta. Circulating cell free DNA: Preanalytical considerations Sep 23; 424: Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B et al. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci Transl Med 2015; 7: 302ra133. Karlovich C, Goldman JW, Sun JM, et al. Assessment of EGFR Mutation Status in Matched Plasma and Tumor Tissue of NSCLC Patients from a Phase I Study of Rociletinib (CO-1686). Clin Cancer Res. 2016;22(10): Luo J, Shen L, zheng D. Diagnostic value of circulating free DNA for the detection of EGFR mutation status in NSCLC: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 2014;4: Merker JD, Oxnard GR, Compton C, et al. Circulating Tumor DNA Analysis in Patients With Cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists Joint Review. J Clin Oncol. 2018;36(16): Normanno N, Denis MG, Thress KS, Ratcliffe M, Reck M. Guide to detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in ctdna of patients with advanced nonsmall-cell lung cancer. Oncotarget 2017;8(7): Novello S, Barlesi F, Califano R, et al. Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2016;27(suppl 5):v1-v27. Oxnard GR, Thress KS, Alden RS, et al. Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AzD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 2016;34(28): Qiu M, Wang J, Xu Y, et al. Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2015;24(1): Rosell R, Moran T, queralt C et al. Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. N Engl J Med 2009; 361:

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