Tracciato di un elettroforesi sieroproteica

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1 Tracciato di un elettroforesi sieroproteica A) Gel di agarosio B) Elettroforesi capillare C) Migrazione delle principali proteine sieriche Elettroforesi su membrana, colorazione con rosso Ponceau

2 ELETTROFORESI CAPILLARE La corsa elettroforetica avviene in fase liquida in un capillare di silice fusa riempito di soluzione elettrolitica Metodo di analisi molto rapido e ad alta risoluzione Lunghezza del capillare: cm Diametro del capillare: µm Usato un volume molto piccolo di siero Alto voltaggio: 8-15 kv Temperatura 24 C Durata corsa= 5 minuti La rilevazione avviene senza colorante Si misura l assorbanza a circa 210 nm da parte di un detector a raggi UV Le proteine migrano in verso opposto rispetto ad una elettroforesi sul gel di agarosio Elettroforesi su gel di agarosio polisaccaride formato da unità di D- galattosio e di 3,6- anidro-l-galattosio Elettroforesi capillare Direzione di migrazione

3 ELETTROFORESI CAPILLARE Campioni di siero Le proteine vengono trascinate dal flusso elettroendosmotico Il risultato viene rappresentato come un elettroferogramma che riporta la risposta del detector in funzione del tempo. Le proteine separate appaiono come picchi con differenti tempi di ritenzione.

4 Transtiretina (TTR) o pre-albumina Proteina globulare non glicosilata, omotetramero PM 55 KDa Si associa alla Retinol Binding Protein (RBP) Lega gli ormoni tiroidei Marcatore negativo della fase acuta Emivita di circa 2,5 gg v. r. 0,2-0,4 g/l Le proteine di fase acuta sono proteine plasmatiche la cui concentrazione aumenta (proteine positive di fase acuta) o diminuisce (proteine negative di fase acuta) in presenza di infiammazione

5 ALBUMINA v.n g/l; 52-68% Principale proteina plasmatica; Struttura primaria: singola catena polipeptidica di 585 AA; MW 66,3 kda; 17 ponti disolfuro, non glicosilata Struttura secondaria: 55% alfa elica Struttura 3D: tre domini omologhi, avvolti in modo ellittico Sintetizzata come pre-pro-albumina (circa 40 amminoacidi in più) e secreta dal fegato Turn over di circa 20 gg Funzioni: Maggior responsabile della pressione oncotica plasmatica Trasporto (acidi grassi, ormoni steroidei e tiroidei, sali biliari, bilirubina non coniugata, ioni metallici, farmaci) E un marcatore negativo della fase acuta

6 IPOALBUMINEMIA Diminuzione delle concentrazioni di albumina per: Diminuzione della sintesi: malnutrizione (scarsa disponibilità di proteine nella dieta), malattia epatica cronica e avanzata Diluizione: aumento dell idratazione Escrezione anomala: sindrome nefrotica, emorragie, ustioni Distribuzione anomala: nello spazio interstiziale, per aumentata permeabilità capillare (nello shock settico) Processi infiammatori: viene privilegiata la sintesi delle proteine positive della fase acuta Gravidanza: per aumento del volume plasmatico Conseguenza: EDEMA

7 ALFA-1-GLOBULINE α-1 antitripsina (AAT) v.r. 0,9-2,0 g/l Glicoproteina monomerica della famiglia delle serpine (Serine Protease Inhibitors) Inibisce l elastasi rilasciata dai neutrofili La sua carenza (per polimorfismi genici) può portare a danno polmonare ed epatico (viene richiesta la sua misura in questi casi) E una proteina positiva della fase acuta α1-glicoproteina acida: proteina positiva di fase acuta diminuisce in presenza di insufficienza epatica o malnutrizione

8 ALFA-2 GLOBULINE Aptoglobina v.r. 0,3-2,0 g/l Tetramero, due catene leggere alfa e due pesanti beta Sintetizzata dal fegato Lega le catene globiniche libere, in caso di emolisi Se diminuita, è indice di emolisi intravasale Proteina positiva della fase acuta stimolata dalle citochine pro-infiammatorie

9 ALFA-2 GLOBULINE α-2 macroglobulina Proteina plasmatica di 720 kda prodotta dal fegato Inattiva numerose proteasi (compresa la trombina) Aumento nella sindrome nefrosica (normalmente non viene filtrata dal glomerulo a causa dell alto MW) Non è una proteina della fase acuta Ceruloplasmina Proteina positiva della fase acuta Proteina a rame Aumenta in gravidanza e con anticoncezionali ormonali Importante marcatore delle malattie genetiche dell omeostasi del RAME

10 Beta 1 e 2 globuline Il picco di beta 1 è determinato dalla transferrina (la proteina che trasporta il ferro nel sangue) (valore elevato nelle anemie da carenza di ferro) quello di beta 2 è determinato dalle lipoproteine che trasportano i lipidi nel sangue (valore elevato per colesterolo alto) Un valore inferiore alla norma è spesso connesso alla malnutrizione o alla cirrosi epatica Fa parte della frazione delle beta globuline anche l emopessina (lega l eme liberato dalle globine in caso di emolisi) Il fibrinogeno si evidenzia in questa frazione nel tracciato del plasma, ma non del siero

11 Beta 1 e 2 globuline SISTEMA DEL COMPLEMENTO Gruppo di proteine plasmatiche (circa 30) sintetizzate dal fegato come zimogeni Partecipa alla risposta immunitaria innata e adattativa Viene attivato a seguito dell interazione antigene-anticorpo L attivazione del complemento avviene a cascata Via Classica Via Alternativa Via della Lectina

12 Beta 1 e 2 globuline COMPONENTI DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO C3 e C4 Fattori del complemento e proteine della loro regolazione (attivatori e inibitori) Cascata multienzimatica dell immunità innata per il killing microbico e modulazione dell immunità acquisita Per valutare lo stato di attivazione del sistema del complemento si misurano i fattori C3 e C4 Proteina C3 del Complemento: aumenta nelle malattie autoimmuni, infiammazioni ed infezioni croniche. Si richiede la loro misura per pazienti con infezioni severe e ricorrenti o con manifestazioni allergiche v.r. C3 = 0,9-1,8 g/l C4 = 0,1-0,4 g/l

13 IMMUNOGLOBULINE (ANTICORPI) MW circa 150 kda Catene leggere Kappa e lambda Catene pesanti Alfa, gamma, delta, epsilon, mu Sulla base delle catene pesanti IgA IgG IgD IgE IgM

14 Pentamero delle unità immunoglobuliniche tipico delle IgM

15 5 diverse Classi di immunoglobuline In base al tipo di catena pesante presente IgA IgG IgD IgE IgM Nel siero sono presenti soprattutto IgG, IgA, IgM

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17 VARIAZIONI A CARICO DEL PROTIDOGRAMMA E PATOLOGIE CORRELATE

18 Proteina c reattiva (PCR) Il marcatore della fase acuta più utilizzato La sua quantità nel siero è indicativa dell entità della flogosi Sintetizzata dagli epatociti su induzione delle citochine pro-infiammatorie (IL-6) prodotte da macrofagi e linfociti T,, in condizioni infiammatorie croniche o acute (infezioni batteriche, virali, e fungine; malattie reumatiche; forme tumorali; necrosi tissutale) Si lega alla parete batterica (opsonizzazione), aumenta la fagocitosi, attiva il sistema del complemento Si chiama così perché reagisce con il polisaccaride C dello pneumococco. Proteina di MW 118 kda, beta-globulina 5 monomeri, ognuno con 206 amminoacidi, simmetria ciclica Emivita nel plasma di circa 24 ore Lega diverse sostanze endogene ed esogene, facilitandone l eliminazione dal circolo v. r. < 5 mg /L, può aumentare anche di 1000 volte Un alta concentrazione di proteina C reattiva nel siero è priva di significato diagnostico fuori dal contesto clinico del paziente

19 La PCR si misura con tecniche immunochimiche o con metodi immunoturbidometrici Se presente nel campione, la PCR interagisce con gli anticorpi anti-pcr di cui il test è provvisto. A seguito di una reazione colorimetrica, compaiono linee colorate che permettono una misurazione semi-quantitativa della concentrazione di PCR nel campione di sangue.

20 MARCATORE TUMORALE o antigene tumore-associato Molecola che può essere messa in relazione alla presenza o alla progressione di un tumore Circolante, rilasciato dalla cellula tumorale Presente sulla superficie o all interno della cellula tumorale Può essere una proteina, un enzima, un ormone La sua presenza in circolo NON è sufficiente per formulare una diagnosi Utile per i pazienti con familiarità per la forma tumorale in oggetto

21 STORIA Nel 1848 Henry Bence Jones associa una proteina presente nelle urine al mieloma e la suggerisce come indicatore della presenza della malattia Bence Jones H. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Phil Trans R Soc London, 1848; 138: La misurazione dei marcatori tumorali è resa possibile possibile grazie allo sviluppo dei metodi immunometrici

22 MARCATORI TUMORALI CIRCOLANTI MISURATI IN BIOCHIMICA CLINICA GLICOPROTEINE CEA (Carcino-Embrionic Antigen): carcinoma del colon-retto CA 19.9 (Antigene Carboidratico): tumori pancreas CA 19.9 e CEA: tumori delle vie biliari CA 125 (Antigene Carboidratico): tumori ovaio CA 15.3 (Antigene Carboidratico) e CEA : carcinoma alla mammella ENZIMI PSA (Prostate Specific Antigen): carcinoma prostata LDH (Lattico Deidrogenasi): tumore rene, ovaio, testicolo, melanoma ORMONI TSH (Thyroid Stimulating Hormone): tumori tiroide HGC (Human Gonadotropin Corionic): coriocarcinoma Calcitonina: carcinoma midollare della tiroide Mesotelina: mesotelioma AFP (Alfa Feto Proteina): epatocarcinoma, tumori testicolo Paraproteina: mieloma multiplo

23 LIMITI DIAGNOSTICI DEI BIO-MARCATORI TUMORALI CIRCOLANTI NON sono sempre specifici del tumore Possono aumentare per compromissione della funzione epatica o renale Bassa sensibilità analitica dei metodi di dosaggio Non sono un marcatore precoce (bene controllare non il valore assoluto, ma l andamento nel tempo) SOLO PER POCHI MARCATORI SI HANNO EVIDENZE SUFFICIENTI DA RACCOMANDARNE L USO CLINICO RACCOMANDAZIONI Non devono essere usati autonomamente, ma sempre in associazione a tecniche di imaging e confermati da evidenze bioptiche Mai utilizzarli come unico criterio per le indicazioni terapeutiche Un singolo valore elevato deve essere confermato con successive misurazioni prima di intraprendere decisioni diagnostiche o interventi terapeutici Nel monitoraggio dei pazienti è importante che la misurazione venga eseguita nello stesso laboratorio e con lo stesso metodo di misurazione

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