Maria Antonietta Lepore. Ruolo delle proteine nella diagnostica

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3 Maria Antonietta Lepore Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio

4 Copyright MMXI ARACNE editrice S.r.l. via Raffaele Garofalo, 133/A B Roma (06) isbn I diritti di traduzione, di memorizzazione elettronica, di riproduzione e di adattamento anche parziale, con qualsiasi mezzo, sono riservati per tutti i Paesi. Non sono assolutamente consentite le fotocopie senza il permesso scritto dell Editore. I edizione: giugno 2011

5 A Vladimiro, con l immenso amore di sempre, Mamma

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7 Indice 9 Prefazione 11 Introduzione 15 Capitolo I Le proteine plasmatiche 21 Capitolo II Elettroforesi delle sieroproteine 49 Capitolo III Elettroforesi delle proteine su gel di agarosio 51 Capitolo IV Elettroforesi dell emoglobina 57 Capitolo V Elettroforesi su gel di amido 59 Capitolo VI Elettroforesi di affinità 7

8 8 Indice 61 Capitolo VII Varianti proteiche 77 Capitolo VIII Metodi di determinazione delle proteine totali 79 Capitolo IX Enzimi e patologie. Metodi di diagnosi 87 Capitolo X Struttura e funzioni 93 Capitolo XI Reazioni enzimatiche accoppiate. Metodi di misura 99 Capitolo XII Enzimi specifici 117 Conclusioni 121 Bibliografia

9 Prefazione Le proteine plasmatiche sono sintetizzate prevalentemente nel fegato, nelle plasmacellule, nei linfonodi, nella milza e nel midollo osseo. Nel corso di varie patologie, la concentrazione di proteine totali e la percentuale delle singole frazioni si diversificano in modo significativo rispetto ai valori normali. L ipoproteinemia può essere causata da ustioni gravi, sindromi nefrosiche, epatopatie croniche. L iperproteinemia può essere rilevata nella disidratazione grave, nelle malattie autoimmuni, in alcune patologie, quale il mieloma multiplo. Il rapporto albumina/globulina, viene universalmente utilizzato come indice della distribuzione delle frazioni delle due proteine. Elevate variazioni di tale rapporto è stato osservato nella cirrosi epatica, nella sindrome nefrosica, nelle epatiti acute, in presenza di varie infiammazioni acute e croniche. La determinazione delle proteine totali è impiegata nella diagnosi e nel trattamento di patologie epatiche, del rene, del midollo osseo e di varie alterazioni funzionali nutrizionali e/o metaboliche. Gli enzimi sono proteine funzionali dotate di attività catalitica. Essi sono catalizzatori specifici, cioè, catalizzano una sola reazione chimica oppure un gruppo di rea- 9

10 10 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio zioni affini, con la caratteristica peculiare di aumentare la velocità delle reazioni catalizzate, rispetto alla velocità con cui decorrerebbero senza di essi. La funzione catalitica degli enzimi è legata strettamente alla loro struttura. La parte della molecola enzimatica che partecipa direttamente alla reazione chimica è denominata sito attivo. Gli enzimi sono classificati in sei gruppi, in relazione al tipo di reazione catalizzata: deidrogenasi, transferasi, idrolasi, ligasi, isomerasi, liasi.

11 Introduzione Le proteine sono polimeri organici ad alto peso molecolare con struttura molto complessa, costituiti da circa venti tipi diversi di aminoacidi, uniti tra loro da legami peptidici per formare una o più catene ripiegate in vario modo, la cui organizzazione tridimensionale è legata strettamente alla loro funzione. Le proteine rivestono ruoli essenziali in molteplici funzioni biologiche, come nel sistema coagulativo plasmatico, nella difesa verso le malattie e molte altre funzioni vitali. Esse sono costituenti primari nella preparazione di molti farmaci salva vita. Inoltre, per alcuni tipi di terapie, unitamente alle proteine estratte da plasma umano, vi è la tecnologia del DNA ricombinante, che determina la sintesi di varie proteine in linee cellulari geneticamente modificate. I farmaci di origine plasmatica sono diversi dai farmaci tradizionali. Infatti, il materiale di partenza è il plasma umano e non un prodotto di sintesi. Le proteine sono degli anfoliti, cioè sostanze che possono comportarsi sia come acidi sia come basi. La ionizzazione del gruppo carbossilico dà luogo alla formazione di cariche negative, mentre l assunzione di protoni sul gruppo amminico determina la presenza di cariche positive. 11

12 12 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio L intensità del fenomeno di ionizzazione dipende dal ph del mezzo in cui sono disciolte le proteine. Il comportamento elettroforetico delle proteine è in relazione al rapporto tra il ph del mezzo e il punto isoelettrico delle proteine. Il punto isoelettrico è quel valore di ph in cui la carica netta è uguale a zero, cioè si ha uguale numero di cariche positive e cariche negative ed il ph = 7. Quando il ph > 7 predominano le cariche positive, cioè la proteina si dissocia come catione e, in un campo elettrico, migra verso il catodo. Quando il ph < 7 predominano le cariche negative, la proteina si dissocia come anione e, in un campo elettrico, migra verso l anodo. Con il termine elettroforesi si definisce la migrazione attraverso un mezzo fluido sotto l influenza di un campo elettrico, di particelle dotate di cariche elettriche. Con questa tecnica si studia la migrazione delle macromolecole per ottenere la loro separazione qualitativa e la loro analisi quantitativa. La separazione si realizza in base alla diversa densità di cariche superficiali delle sostanze da separare. L elettroforesi trova la sua principale applicazione in campo biochimico e biochimico clinico, nello studio qualitativo e quantitativo delle proteine. L elettroforesi delle proteine è detta zonale, perché la separazione elettroforetica delle proteine poste in una soluzione elettrolitica ad un ph costante in un campo elettrico applicato, avviene in base alla loro carica elettrica, alle loro dimensioni e si separano in bande o zone, che sono le bande elettroforetiche. Nell elettroforesi delle proteine viene universalmente impiegato il tampone Veronal Veronal sodico a ph 8. 6, perché riduce i disturbi di diffusione.

13 Introduzione 13 La diffusione è un fenomeno in cui le bande elettroforetiche si sovrappongono, non sono più nette e non si separano distintamente. Il tampone ha la doppia funzione di trasportare la corrente applicata e di determinare la carica elettrica delle proteine. Uno strumento per eseguire correttamente l elettroforesi delle proteine è formato da un mezzo di supporto, che sono le strisce di acetato di cellulosa, una camera di migrazione e un alimentatore di corrente ad intensità o voltaggio costanti. La camera è divisa in due scomparti contenente il tampone in uguale livello, con un elettrodo inserito in ciascuno di essi. Avvenuta la separazione, le proteine vengono rivelate mediante bande colorate lette con adatti fotocolorimetri o densitometri, che traducono graficamente in picchi l intensità di colore e l ampiezza delle bande e misurano automaticamente l area sottesa a ciascun picco. L area è proporzionale alla quantità di colore legato e, quindi, alla concentrazione proteica. Utilizzando il tampone di Michaelis, Veronal Veronal sodico a ph 8,6, le proteine vengono separate elettroforeticamente su supporto di acetato di cellulosa, in 5 frazioni denominate: albumina, α1 globuline, α2 globuline, β globuline e γ globuline, in relazione alla loro mobilità elettroforetica decrescente. Gli enzimi sono biocatalizzatori capaci di accelerare le reazioni chimiche che avvengono nell organismo, aumentando la velocità di reazione senza alterarne le caratteristiche. La maggior parte degli enzimi svolge la sua attività dentro le cellule dove sono prodotti. Perciò, le variazioni della loro concentrazione, misurata universalmente in Unità Internazionale (UI), riflettono il danno relativo alle cellule o ai tessuti di provenienza.

14 14 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio Le misurazioni enzimatiche nel siero sono di grande utilità per rilevare e valutare la gravità del danno tessutale. Molti enzimi hanno una distribuzione ubiquitaria nell organismo e un elevato livello serico non indica in modo specifico l organo danneggiato. Tuttavia, alcuni sono strettamente organo specifici e, in questo caso, si misurano i livelli degli enzimi più attivi in alcune cellule o tessuti oppure si identificano gli isoenzimi.

15 Capitolo I Le proteine plasmatiche Il termine proteina deriva dalla parola greca pròteios che significa di primaria importanza. Infatti, le proteine hanno un ruolo fondamentale in tutti i processi biologici. Le molecole di aminoacidi che normalmente sono presenti nelle proteine, sono disposte, in ogni catena polipeptidica, in una serie ordinata che si sussegue con accuratezza e precisione per ciascuna proteina. Le proteine possono essere classificate in relazione alla loro struttura e composizione oppure in base alla loro funzione. Le proteine plasmatiche si trovano disciolte nel plasma e costituiscono circa il 6% del volume totale del sangue. Esse rappresentano varie forme di proteine circolanti, che rivestono numerose funzioni biologiche, tra le quali, per esempio, il trasporto di molecole lipofile, che altrimenti non potrebbero veicolare se non legate a molecole che ne consentono il trasporto e gli enzimi con la conseguente regolazione dell attività catalitica. Nel plasma sono contenuti 6 8 g/dl di proteine con peso molecolare e funzioni eterogenee. In relazione alla loro funzione sono classificate in: enzimi; proteine di trasporto; 15

16 16 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio fattori della coagulazione e della fibrinolisi; immunoglobuline; frazioni del complemento; ormoni; funzione nutritiva; proteine di mantenimento della pressione osmotica. Le proteine plasmatiche sono sintetizzate in gran parte dal fegato, ad eccezione delle immunoglobuline che sono sintetizzate dalle plasmacellule; alcuni componenti del complemento che sono sintetizzati dai macrofagi; alcune lipoproteine che sono sintetizzate dalle cellule intestinali; degli ormoni; di alcuni enzimi e degradate e/o eliminate a livello epatico e gastrointestinale. Il fegato, quindi, svolge un ruolo molto importante, anche perché è capace di utilizzare gli aminoacidi sia per la sintesi di numerose proteine sia di trasformarli in altri composti azotati e/o in altri substrati fondamentali per la vita dell organismo. Inoltre, il fegato può dirigere e distribuire le proteine verso differenti destini, in base alle richieste dell organismo. Il fegato, pertanto, è l organo chiave nella sintesi di molte proteine plasmatiche; infatti, la loro concentrazione diminuisce, non a caso, nelle epatopatie. La sintesi delle proteine plasmatiche è influenzata soprattutto dallo stato generale di salute dell organismo, dallo stato nutrizionale e da alcuni fattori ormonali. Albumina e globulina rappresentano oltre il 90% delle proteine plasmatiche circolanti nel sangue. L albumina, sintetizzata dalle cellule parenchimali del fegato, ha una emivita di circa 20 giorni. Il livello normale è 3,5 5,0 g/dl, corrispondente a circa il 60% delle proteine totali.

17 i. Le proteine plasmatiche 17 Ha una importantissima funzione di mantenimento della pressione colloide osmotica del sangue e un altrettanto importante funzione di trasporto di sostanze esogene ed endogene, quali bilirubina, lipidi, ormoni steroidei, farmaci, coloranti, metalli, vitamine. Aumenta nei fenomeni di disidratazione, come vomito, diarrea e diminuisce nella denutrizione, nel malassorbimento, per diminuita sintesi, per aumentato catabolismo, per perdite esogene. Le globuline rappresentano circa il 30% delle proteine totali, hanno una struttura terziaria a simmetria sferica, un elevato peso molecolare e si suddividono in tre frazioni: α, β, γ. Le prime due hanno funzioni di trasporto, la terza comprende le immunoglobuline con funzione di difesa dell organismo. Il fibrinogeno è una glicoproteina prodotta dal fegato, costituita da sei subunità e rappresenta il 5% delle proteine totali. È la frazione quantitativamente più importante delle plasmaproteine che non si ritrova nel siero. Il fibrinogeno rappresenta un valido indice che concorre alla diagnosi di varie patologie, quali malattie epatiche, stati infiammatori, coagulazione intravascolare disseminata (CID). Un elevato valore di fibrinogeno si riscontra anche durante la gravidanza oppure in relazione all uso di contraccettivi orali. Il siero è il plasma privo di fibrinogeno e quanto resta del plasma dopo il processo coagulativo. Il fibrinogeno, quindi, interviene nel processo di coagulazione del sangue. Quando la sua concentrazione aumenta notevolmente nei processi infiammatori acuti di varia natura, il fibrinogeno viene definito proteina della fase acuta.

18 18 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio Diminuisce in presenza di una ridotta funzionalità epatica, quali cirrosi o malattie croniche del fegato e/o in tutte le gravi epatopatie, nella coagulazione intravascolare disseminata per l eccessivo consumo a causa della formazione di numerosi trombi, per disordini ereditari. La diminuzione, solitamente, è associata ad una terapia trombolitica. La determinazione quantitativa del fibrinogeno si valuta aggiungendo un eccesso di trombina al plasma diluito in esame, che converte il fibrinogeno in fibrina. La velocità della reazione dipende dalla concentrazione di fibrinogeno del campione in esame. Si utilizza trombina bovina liofilizzata, 35 UNIH/ml, con aggiunta di albumina bovina, calcio cloruro 0, 025 M, tampone e stabilizzanti. Il campione viene preparato aggiungendo nove parti di sangue venoso fresco ad una parte di trisodio citrato. La determinazione del fibrinogeno può essere influenzata da numerose variabili e soprattutto dalla presenza di prodotti di degradazione della fibrina e del fibrinogeno. I risultati dei valori possono essere riportati con varie unità di misura: mg/dl; g/l; secondi. È universalmente accreditata la prima delle tre unità di misura, con valori di riferimento mg/dl. Le proteine sono classificate in proteine semplici, costituite da una sola catena lineare di aminoacidi e proteine coniugate, rispettivamente, polipeptide e struttura primaria, struttura secondaria, struttura terziaria, struttura quaternaria.

19 i. Le proteine plasmatiche 19 La composizione, costituita da quattro livelli, è così formata: struttura primaria, formata solo da aminoacidi legati tra loro da legami peptidici; struttura secondaria, α elica e struttura β a foglietti ripiegati, determinata dalla disposizione nello spazio di residui aminoacidici vicini tra loro; struttura terziaria, determinata dalla disposizione nello spazio di residui aminoacidici lontani tra loro e uniti da ponti disolfuro; struttura quaternaria, che riguarda solo le proteine costituite da due o più catene polipeptidiche e corrisponde al ripiegamento nello spazio delle loro catene, come per esempio, l emoglobina, costituita, nell adulto, da due catene α e due catene β nell HbA, due catene α e due catene δ nell HbA2. È importante ricordare che la distinzione tra struttura secondaria e struttura terziaria non è netta. Lo studio delle proteine del plasma è fondamentale perché esse rivestono una posizione strategica nell ambito del metabolismo proteico generale e consentono di ottenere informazioni importanti sullo stato generale del metabolismo organico. Nella suddivisione che riguarda la composizione chimica, si distinguono: proteine semplici costituite solo da aminoacidi, come l albumina; proteine complesse coniugate ad altri composti, quali zuccheri (glicoproteine), lipidi (lipoproteine) oppure legate a metalli.

20 20 Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio In relazione alla solubilità, l albumina è solubile in acqua, le globuline sono solubili in soluzioni saline diluite. La funzione catalitica è determinata dagli enzimi. La funzione di trasporto è destinata al veicolo di sostanze esogene ed endogene, quali bilirubina, lipidi, farmaci, vitamine, ormoni steroidei, coloranti, metalli. La funzione di difesa viene svolta dalle immunoglobuline o anticorpi e dai fattori del complemento. Lo svolgimento della funzione nutritiva è destinato prevalentemente all albumina. Nella funzione di coagulazione e di fibrinolisi sono coinvolte le proteine che intervengono nell evento coagulativo e fibrinolitico, in forma inattiva, come il fattore II o protrombina oppure nella forma attivata, della via intrinseca e della via estrinseca, che convergono nella via comune per formare il fibrinogeno e la fibrina solubile, poi stabilizzata dal fattore XIII attivato. Le proteine plasmatiche deputate alla coagulazione sono contenute anche negli α granuli piastrinici dai quali fuoriescono quando le piastrine accorrono, emettendo pseudopodi, nella lesione di un vaso con perdita ematica. Le proteine del plasma si riscontrano anche negli spazi extravascolari, quali liquido interstiziale, liquido cefalorachidiano, liquido sinoviale nei quali, nel corso di infiammazione, quando la concentrazione delle proteine è contenuta, si forma il trasudato, quando, invece, la concentrazione delle proteine è molto alta, maggiore di 25 g/l, si forma l essudato.