Carla Zacconi, Gianluigi Scolari e Piergiacomo Sarra Istituto Microbiologia Università Cattolica Piacenza

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1 Carla Zacconi, Gianluigi Scolari e Piergiacomo Sarra Istituto Microbiologia Università Cattolica Piacenza Interazioni microbiologiche nella produzione di insaccati carnei a pezzo anatomico intero Interventi di bioconservazione contro Listeria monocytogenes

2 Classificazione Regno II: batteri Phylum VIII : firmicutes (Sezione XXII : Bacilli e Lattobacilli) Classe I : bacillales Famiglia I : Lactobacillaceae genere Lactobacillus Famiglia II : Leuconostocaceae generi Leuconostoc, Oenococcus, Weissella Famiglia III : Streptococcaceae generi Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus Famiglia IV : Enterococcaceae generi Enterococcus, Melissococcus, Vagococcus Ordine II : Lactobacillales Famiglia V : Carnobacteriaceae generi Carnobacterium ed altri FamigliaVII : Listeriaceae generi Brochotrix, Listeria Famiglia VIII : Staphyloccoccaceae generi Macrococcus, Staphylococcus

3 Classificazione Genere Listeria L. monocytogenes L. seeligeri L. innocua L. welshimeri L. ivanovii L. grayi (+ L. murray) L. ivanovii subsp. ivanovii L. ivanovii subsp. londoniensis

4 Subtipizzazione Quasi esclusivamente isolati dagli alimenti 1/2c L. monocytogenes 13 serotipi patogeni 1/2b 1/2a 4b 95% isolati da soggetti colpiti in epidemie

5 Adattato da Fenlon D.R., 1999 Silage Plants Manure Ruminants Other meat producing animals and fish Soil Water Liquid milk Carcass cuts Equipment and Environmental sources Whole vegetables Sewage Processed food products Humans

6 Proprietà Caratteristica termica di sviluppo: Psicrotrofia temperatura Tempo di generazione (h) Indagine su 50 ceppi di L. monocytogenes Resistenza agli stress: Tempo di latenza (h) Barbosa et al al limite della termoduricità (68 C x 30 min, LTLR) NaCl aw potenziale red-ox (sous vide, atmosfere modificate, ecc.) Nitriti

7 Ambiente carni

8 Uyttendaele & Debevere, 1999 Raw cured meat product Raw cured ham Cooked meat product Cooked ham (before slicing) Cooked ham (after slicing) Dry fermented sausages % % 4.90 % 1.56 % 6.65 % %

9 Listeria monocytogenes Bioprotezione Il concetto di protezione/conservazione biologica si riferisce all uso di microrganismi autoctoni antagonisti, o dei prodotti del loro metabolismo, per inibire o distruggere microflore indesiderate.

10 Listeria monocytogenes Griglia dei criteri di selezione di ceppi inibitori Autoctonia e capacità di insediamento nell alimento Sopravvivenza alle condizioni di conservazione Metabolismo caratterizzato da un basso potere alterante Espressione di attività antagonista Posizione tassonomica certa e garante della food safety Possibilità di modulare il microbiota alterante mediante competizione trofica

11 Circa il 3% dei 600 isolati, esaminati nella precedente ricerca, ha mostrato attività antagonista in prove di inibizione in vitro nei confronti di un cocktail di ceppi di Listeria monocytogenes e di Listeria innocua

12 Sperimentazione Verifica in substrato modello dell attività inibente già evidenziata in vitro. Caratterizzazione biochimica e molecolare dei ceppi inibitori. Selezione dei ceppi inibitori e formulazione dello starter più idoneo da utilizzare in prodotti sperimentali. Verifica dell insediamento/dominanza delle colture starter utilizzate nei prodotti sperimentali.

13 7,7 log ufc/g 7,2 6,7 6,2 5,7 lis test lis ent ent lis m ac m ac Inibizione di Listeria spp, da parte di Enterococcus e Macrococcus in funzione delle concentrazioni iniziali delle varie colture 5, giorni log ufc/g 6,2 5,2 4,2 3,2 lis test lis ent ent lis m ac m ac 2, giorni

14 Sperimentazione Verifica in substrato modello dell attività inibente già evidenziata in vitro. Caratterizzazione biochimica e molecolare dei ceppi inibitori. Selezione dei ceppi inibitori e formulazione dello starter più idoneo da utilizzare in prodotti sperimentali. Verifica dell insediamento/dominanza delle colture starter utilizzate nei prodotti sperimentali.

15 Metodiche di identificazione tassonomica tests biochimici: fermentazione carboidrati, attività enzimatiche e riduzione dei nitrati tests genetici: ARDRA analisi della sequenza del gene per il 16S rrna Posizione tassonomica 97% di omologia con Macrococcus caseolyticus e 70% Staphylococcus sciuri

16 Sperimentazione Verifica in substrato modello dell attività inibente già evidenziata in vitro. Caratterizzazione biochimica e molecolare dei ceppi inibitori. Selezione dei ceppi inibitori e formulazione dello starter più idoneo da utilizzare in prodotti sperimentali. Verifica dell insediamento/dominanza delle colture starter utilizzate nei prodotti sperimentali.

17 Sperimentazione Verifica in substrato modello dell attività inibente già evidenziata in vitro. Caratterizzazione biochimica e molecolare dei ceppi inibitori. Selezione dei ceppi inibitori e formulazione dello starter più idoneo da utilizzare in prodotti sperimentali. Verifica dell insediamento/dominanza delle colture starter utilizzate nei prodotti sperimentali.

18 Monitoraggio delle cellule delle colture inoculate Semina in piastra su terreni selettivi specifici per Macrococcus e Staphylococcus Isolamento di colonie alle diluizioni più elevate Analisi molecolare degli isolati: genotipizzazione con marcatori molecolari AFLP Il profilo genetico di più dell 80% degli isolati corrisponde al ceppo di Macrococcus caseolyticus inoculato

19 Criteri di selezione soddisfatti dalla coltura inibente Autoctonia e capacità di insediamento nell alimento Sopravvivenza alle condizioni di conservazione Metabolismo caratterizzato da un basso potere alterante Espressione di attività antagonista Posizione tassonomica certa e garante della food safety Possibilità di modulare il microbiota alterante mediante competizione trofica