Allineamento multiplo

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1 Allineamento multiplo

2 Allineamenti multipli Vs. allineamenti a coppie A 1: 2: 3: 4: 5: 6: B 1: 2: 3: 4: 5: 6:

3 Significato biologico dell allineamento multiplo L allineamento multiplo riassume La storia evolutiva di una famiglia di proteine Quindi, si possono ricavare informazioni su: - La conservazione dei residui dipendente dalla funzione - La conservazione dei residui dipendente dalla struttura

4 Significato funzionale della conservazione Conservazione degli amino acidi catalitici in alcuni membri della famiglia della tripsina

5 Propensità catalitica dei gruppi funzionali delle proteine hydrophilic hydrophilic/hydrophobic hydrophobic

6 Significato strutturale dell allineamento multiplo 1 G C L W YC Sequenze divergenti del dominio costante delle immunoglobuline allineate manualmente sulla base dell informazione della struttura di uno dei membri della famiglia (PDB 1tlk). Si noti la presenza di inserzioni o delezioni soprattutto in regioni corrispondenti a loop. Due residui di cisteina che formano un ponte disolfuro nel core idrofobico della proteina sono conservati in tutti i componenti della famiglia.

7 Informazioni Informazioni derivate derivate da da un un allineamento allineamento multiplo multiplo Negli enzimi, le regioni maggiormente conservate corrispondono probabilmente al sito attivo La conservazione di residui idrofilici ha spesso un significato funzionale (catalisi). La conservazione di residui idrofobici ha spesso un significato strutturale Regioni ricche di inserzioni/delezioni corrispondono a loops. Glicine o proline conservate corrispondono spesso a turn Un pattern conservato di residui idrofobici alternati a residui idrofilici suggerisce un filamento beta superficiale. Un pattern conservato di residui idrofobici ogni 4 residui suggerisce l'esistenza di un alfa elica. Coppie di cisteine invarianti possono formare ponti disolfuro (in particolare nelle proteine secrete).

8 Difficoltà dell allineamento multiplo Funzione oggettiva di punteggio - Peso da assegnare alle varie sequenze Complessità del problema - Tempo di elaborazione

9 Complessità di calcolo dell allineamento multiplo Sulla superficie del cubo si hanno le matrici di confronto a coppie tra le sequenze A-B, B-C e A-C. L allineamento ottimale di tre sequenze (A-B-C) richiede il riempimento del cubo e la valutazione di tutte le possibili mosse all interno del cubo. La complessità di questo algoritmo è O(LN), dove L è la lunghezza e N il numero delle sequenze. Per tre sequenze di 300 amino acidi il numero di confronti è 2.7 x 107. Un algoritmo completo di programmazione dinamica è utilizzabile solo nel caso di tre sequenze.

10 Metodi per l allineamento multiplo Allineamento ottimale Programmazione dinamica (MSA) Allineamento euristico Progressivo globale (CLUSTALW,Pileup) locale (PIMA) Iterativo globale (PRRP) locale (DIALIGN)

11 Allineamento progressivo Allineamento di tre sequenze A, B, C per passi successivi Allineamento della coppia A-B Aggiunta della coppia C al precedente allineamento Allineamento multiplo DGEKFGPPQRSGQRSG.. DGERFGP-QRSGNRSG consenso + SeqB DHEKFGSSQRSGQRSG DGEKFGPPQRSGQRSG.. DGERFGP-QRSGNRSG.... DHEKFGSSQRSGQRSG SeqA SeqC SeqA SeqB SeqC

12 Allineamento progressivo L'ordine di aggiunta delle sequenze è molto importante Il primo passo di un allineamento consiste nella scelta dell'ordine di aggiunta delle sequenze. Per questo vengono fatti tutti i possibili confronti a coppie (N*(N-1)/2) e viene costruito un albero per rappresentare le somiglianze. L'albero stabilisce l'ordine di aggiunta delle sequenze

13 Clustal: Clustal: schema schema N(N-1)/2

14 Clustal: Clustal: allinamento allinamento progressivo progressivo

15 Clustal Higgins & Sharp 1988 ClustalW (improved) Thompson et al 1994

16 Punteggio pesato nell allineamento multiplo Seq1 Seq2 Seq3 Seq4 Seq1 G Seq2 G A A A A G G G A A A A G A A C C Seq1 G Seq3 A G G A Seq3 Seq4 Somma delle coppie (non pesata) Seq4 G Seq2 Punteggio pesato in base alla relazione filogenetica delle sequenze Viene usato il metodo della somma pesata delle coppie in ogni colonna per determinare il punteggio totale dell allineamento. Questo metodo assegna un peso alle sequenze in modo da aumentare il punteggio in confronti tra sequenze evolutivamente distanti e diminuirlo in confronti tra sequenze vicine.

17 CLUSTALW improvement Thompson et al 1994 Le sequenze filogeneticamente più distanti ricevono un peso (weigth) proporzionalmente più alto nell allineamento Le sequenze più distanti ricevono un peso (weigth) maggiore nel punteggio

18 CLUSTALW improvement Thompson et al 1994 La penalità da assegnare ai gap dipende dal tipo di residui (Pascarella & Argos) come osservato in sequenze a struttura nota La penalità dipende anche dalla posizione. Se ci sono gap nelle vicinanze la penalità aumenta

19 CLUSTALW e CLUSTALX CLUSTALX. Stesso algoritmo di CLUSTALW con interfaccia grafica

20 Allineamento iterativo STOP IF CONVERGED W Il primo allineamento multiplo viene usato per predire un nuovo albero, nuovi pesi e nuovi allineamenti fino a che non si ha un miglioramento nel punteggio dell allineamento. Implementato in PRRP, DIALIGN

21 Comparazione dei metodi di allineamento multiplo Thompson et al 1999 Set di riferimento BAliBASE Una bancadati di proteine allineate strutturalmente e suddivisa in set che rappresentano problemi tipici che si hanno in allineamenti multipli: - estensioni terminali - inserzioni - famiglia rispetto ad orfani

22 Colonne correttamente allineate Comparazione dei metodi di allineamento multiplo V3= >35% id. V2= 20-40% id. Large family V1= <20% id. Small family Sequenze di lunghezza simile Orfani allineati ad una famiglia Sequenze con estensioni terminali Conclusioni: 1) per sequenze di lunghezza comparabile i sistemi globali e iterativi funzionano meglio; 2) per allineare una sequenza orfana ad una famiglia conviene usare molti membri della famiglia 3) se le sequenze presentano diverse estensioni alle estremità N e C terminali conviene utilizzare sistemi di allineamento locale

23 Visualizzare ed editare allineamenti: GeneDoc

24 Rappresentazioni dell allineamento multiplo: conservazione

25 Rappresentazioni dell allineamento multiplo: sostituzioni

26 Decorazione di allineamenti con elementi strutturali: ESPRIPT Legame con in metallo Catalisi

27 Applicazioni dell allineamento multiplo Inferenze struturali Definizione di famiglie Inferenze funzionali Alberi filogenetici Primers per PCR Consensi, motivi Profili, modelli markoviani, logos

28 Rappresentazioni probabilistiche della conservazione dei residui in un A.M. Profili Modelli markoviani (profili HMM) Sequence logos

29 Sequence logos Rappresentazione grafica del grado di conservazione delle colonne dell allineamento. Nella forma più comune, la conservazione dell'allineamento è espressa in bits (log2). La misura deriva dalla teoria dell informazione di Shannon: Massima incertezza di osservare uno su M simboli con probabilità P: H = log2(m) = - log2(p) Quando i simboli non sono equiprobabili si utilizza la formula generale di Shannon M H Pi log 2 ( Pi ) i 1

30 Nucleotide and protein sequence logos Nel grafico è rappresentata in ordinata la conservazione come diminuzione di incertezza. Per i nucleotidi Per i gli aminoacidi log2(4) - H. log2(20) - H La massima conservazione in bits è quindi 2 per i nucleotidi e 4.32 per gli amino acidi.

31 Profili Gribskov et al 1987 ALLINEAMENTO MULTIPLO HBA_HUMAN HBB_HUMAN MYG_PHYCA GLB3_CHITP GLB5_PETMA LGB2_LUPLU GLB1_GLYDI...vga--hagey......v----nvdev......vea--dvag vkg------d......vys--tyets......fna--nipkh......iagadngagv... PROFILI: Rappresentano un allineamento multiplo assegnando a ciascuna posizione dell'allinamento un punteggio per l'occorrenza di uno tra i possibili simboli.

32 Costruzione di un profilo Gribskov et al 1987 ALLINEAMENTO MULTIPLO HBA_HUMAN HBB_HUMAN MYG_PHYCA GLB3_CHITP GLB5_PETMA LGB2_LUPLU GLB1_GLYDI...vga--hagey......v----nvdev......vea--dvag vkg------d......vys--tyets......fna--nipkh......iagadngagv... Le colonne dell'allinemento corrispondono alle righe della matrice PROFILO DELL'ALLINAMENTO MULTIPLO Cons V A A A D N V A E V A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Gap Len

33 Costruzione di un profilo Gribskov et al 1987 ALLINEAMENTO MULTIPLO HBA_HUMAN HBB_HUMAN MYG_PHYCA GLB3_CHITP GLB5_PETMA LGB2_LUPLU GLB1_GLYDI...vga--hagey......v----nvdev......vea--dvag vkg------d......vys--tyets......fna--nipkh......iagadngagv... Score associati alla presenza dei simboli nelle colonne dell'allineamento Penalità allungamento gap Penalità apertura gap Cons V A A A D N V A E V A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Gap Len

34 Calcolo dei punteggi nei profili ALLINEAMENTO MULTIPLO HBA_HUMAN HBB_HUMAN MYG_PHYCA GLB3_CHITP GLB5_PETMA LGB2_LUPLU GLB1_GLYDI...vga--hagey......v----nvdev......vea--dvag vkg------d......vys--tyets......fna--nipkh......iagadngagv... Punteggio di un aminoacido X per la prima colonna: s (V, X ) s ( F, X ) s ( I, X ) Dove s(y,x) è il punteggio della sostituzione dell aminoacido Y in X nelle matrici PAM o BLOSUM.

35 PSI-Blast Position-Specific Iterated Blast

36 Schema Schema di di funzionamento funzionamento di di PSIPSIBLAST BLAST La ricerca utilizza una singola sequenza sonda per la prima iterazione e, per le iterazioni successive una matrice di punteggio specifica per posizione (PSSM, Position Specific Scoring Matrix) costruita a partire da un allineamento multiplo. I passaggi utilizzati da PSI-BLAST sono i seguenti Ricerca BLAST con una singola sequenza sonda (1 iterazione); Le sequenze significativamente simili (secondo una soglia di E, modificabile) sono utilizzate per un allineamento multiplo.l allineamento multiplo è utilizzato per calcolare una PSSM La PSSM viene utilizzata per una seconda ricerca (2 iterazione); La 2 iterazione può trovare nuove sequenze significative che possono essere utilizzate per costruire una nuova PSSM. La ricerca può essere iterata fino a quando vengono trovate nuove sequenze

37 PSI-Blast Iterazione n 2 Risultato della ricerca e valori di significatività basati sulla matrice posizione specifica

38 Hidden Markov Models (HMM) transizioni Krog, Haussler Eddy, Durbin stato Gli Hidden Markov Models (HMM) sono una classe di modelli probabilistici che si applicano a serie temporali o sequenze lineari. Un modello è caratterizzato da una determinata architettura composta da stati e da transizioni di stato. Ciascuno stato ha una data probabilità di emettere simboli o di effettuare una transizione. Il modello in figura rappresenta sequenze composte da due lettere (a,b) generate da due stati, ciascuno con una diversa probabilità di emissione. Partendo dalla stato 1 il modello ha generato una sequenza (aba) attraverso una successione di stati. Ciò che viene osservata è la sequenza di simboli, mentre la successione degli stati rimane nascosta (hidden). La probabilità combinata P(x, HMM) della sequenza di simboli osservata è il prodotto di tutte le probabilità di emissioni e transizioni.

39 Profili HMM inserzione match delezione Gli HMM possono essere usati per modellare allineamenti multipli di sequenze di una data famiglia (profili HMM). L architettura del modello prevede tre tipi di stati (m=match, i=inserzione, d=delezione), più uno stato finale (e=end) ed uno stato iniziale (b=begin). L HMM rappresentato in figura modella l allineamento multiplo delle cinque sequenze (tre colonne) sopra visualizzato. La probabilità di emissione dei vari aminoacidi derivano dalle frequenze osservate nell allineamento. Modelli generati con allineamento multipli possono essere impiegati per: 1) allineare nuove sequenze al modello; 2) individuare in un database sequenze aderenti al modello; 3) individuare corrispondenze tra una sequenza e un database di modelli.

40 Profili HMM: architettura e valori parametri I0 BEGIN I1 tm1i1 m1 tm1m2 m2 m8 END seq1 seq2 seq3 seq4 seq5 seq6 Seq xxx--xxxxx x----xxxxx xxx--xxxxxxx------x xxx--xxxxx xxx--xxxxx xxxxxxxxxx tm1d2 D1 D2 Gli stati match corrispondono alle colonne in cui i simboli prevalgono sui gap. I parametri iniziali dipendono dal numero di simboli emessi e dal numero di transizioni (frecce che partono da uno stato). In questo modo, prima di leggere un allineamento le probabilità di emissione di ciascun amino acido dello stato m1 saranno em1(x) = 1/20, Le probabilità di transizione dallo stato m1 saranno tm1m2=1/3, tm1d2=1/3, tm1i1 =1/3. I valori dei parametri vengono quindi modificati in base all allineamento in ragione delle occorrenze dei caratteri in una colonna e le occorrenze delle transizioni.

41 Profili HMM: pseudocounts I1 I0 BEGIN HBA_HUMAN HBB_HUMAN MYG_PHYCA GLB3_CHITP GLB5_PETMA LGB2_LUPLU GLB1_GLYDI m1 m2 D1 D2 m8 vga--hagey v----nvdev vea--dvagvkg------d vys--tyets fna--nipkh iagadngagv END Quando una transizione o l emissione di un particolare simbolo non si osserva è necessario aggiungere finti conti ( pseudocounts ) per evitare valori di probabilità zero. Il sistema più semplice di pseudocounts è la regola di Laplace: aggiungere 1 a tutte le frequenze. Usando questo sistema nella prima colonna occorre aggiungere 17 conti per gli aminoacidi mancanti. Il numero totale sarà quindi (5+1)V+(1+1)F+(1+1)I+(0+17)x = 27. Le probabilità di emissione saranno e m1(v)= 6/27, em1(i)=2/27, em1(f)=2/27, em1(x)=1/27. Analogamente per le probabilità di transizione, in cui osserviamo 6 transizioni allo stato di match, 1 allo stato di delezione e zero allo stato di inserzione: t m1m2=7/10, tm1d2=2/10, tm1i1= 1/10. Questo sistema di pseudocount funziona solo quando il campione di sequenze è sufficientemente numeroso (>50); in altri casi vanno usati sistemi più sofisticati (misture di Dirichlet, misture basate sulle matrici di sostituzione, stime basate sull ancestore).

42 Profili HMM: weighting I parametri dell HMM vanno stimati assegnando un peso minore all informazione portata da sequenze simili ed un peso maggiore all informazione portata da sequenze più divergenti. Vi sono metodi di weighting basati su alberi filogenetici ed altri indipendenti da questi (Voroni, Maximum discrimination, Maximum Entropy). Tutti i sistemi di weighting soffrono di un problema comune. Se in un modello di una famiglia si inserisce una sequenza errata (non appartenente alla famiglia) questa avrà in proporzione molto peso sul modello finale. V In un intuitivo sistema di weighting si immagina di applicare un voltaggio alla radice dell albero e di pesare le sequenze in proporzione alla corrente che arriva a ciascun nodo.

43 Profilo HMM: Log odds scores emissioni(m) emissioni(i) transizioni

44 Questioni legate ai profili HMM Dato un allineamento, quali soni i valori dei parametri di un HMM che descrivono nel modo migliore possibile la conservazione (APPRENDIMENTO)? - costruzione di un HMM Qual è la sequenza ottimale di stati con cui un HMM genera una data sequenza (ALLINEAMENTO)? - allineamento di una sequenza all'hmm (Viterbi algorithm) Qual è la probabilità che una data sequenza sia stata generata da un dato HMM (VEROSIMIGLIANZA)? - appartenenza di una sequenza ad una famiglia descritta con HMM

45 Hmmer Sean Eddy Hmmer (pronunciato hammer ) è un pacchetto di programmi per creare ed usare modelli markoviani di allineamenti di DNA e proteine. I programmi principali sono: - Hmmbuild: creare un HMM a partire da un allineamento - Hmmalign: allineare sequenze ad un HMM - Hmmsearch: cercare un database di sequenze con un HMM - HMMpFAM: cercare un database di modelli con una sequenza

46 Protein family PFAM (acronimo di Protein Families) è un database di domini di proteine descritti con modelli markoviani. E diviso in due sezioni: pfam-a contiene allineamenti curati da esperti; pfam-b contiene sequenze che vengono automaticamente raggruppate.

47 Pfam

48 Pfam: family description

49 Ricerca di omologia in Pfam: anatomia delle proteine

50 Allineamento Allineamento tra tra HMMs HMMs Söding J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21: (2005).