Allineamenti Multipli

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1 Allineamenti Multipli Finora ci siamo occupati di allineamenti a coppie (pairwise), ma il modo migliore per conoscere le caratteristiche di una determinata famiglia è allineare molte proteine a funzione analoga. I siti funzionalmente o strutturalmente più rilevanti tendono a mantenersi invariati nelle proteine omologhe, mentre i siti meno importanti possono cambiare anche molto. Osservare e studiare le conservazioni significa capire come le famiglie di proteine funzionano, cosa la rende diverse o comuni tra loro, se esistono o meno relazioni filogenetiche inter e intrafamiglia. In questo modo è possibile individuare la funzione di una proteina ignota solo osservando la sequenza di questi siti.

2 Concettualmente non c`e` ragione perche` l`algoritmo di Needleman- Wunsch non possa essere usato con piu` di due sequenze. La matrice, da bidimensionale, diventa multi-dimensionale. Esiste tuttavia un problema pratico: il tempo computazionale impiegato non cresce piu` con il quadrato delle lunghezze ma con N m dove m rappresenta il numero di sequenze. Per un allineamento multiplo di 5 sequenze lunghe 100: =10,000,000,000 numero di operazioni richieste. Metodi euristici Allineamento progressivo (ClustalW) Metodi iterativi Metodi basati su zone comuni di sequenza conservate Metodi statistici e modelli probabilistici

3 ClustalW Idea di base: se una proteina può essere allineata con una seconda e una seconda con una terza, allora deve esistere un allineamento che le comprenda tutte e tre. Tre step principali: 1) Tutte le coppie di sequenze sono allineate separatamente al fine di calcolare una matrice di distanza che contiene la divergenza tra ogni coppia di sequenza. 2) Sulla base della matrice viene calcolato un albero. 3) Le sequenze sono progressivamente allineate sulla base dell`ordine dato dall`albero.

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5 Allineamento a coppie/matrice di distanza 2 metodi per l`allineamento a coppie: 1- metodo approssimato ma molto veloce (permette di allineare grandi quantita` di sequenze in poco tempo) 2- programmazione dinamica che usa due gap penalty (open e extending) e una metrice di peso (piu` lento ma piu` accurato) Calcolo delle distanze: primo metodo: numero di k-tuples (numero di residui identici) meno una penalita` fissa per ogni gap. secondo metodo: numero di residui identici diviso il numero di residui (i gap non sono considerati) Entrambi i punteggi sono divisi per 100 e sottratti a uno per dare il numero delle differenze per sito.

6 Costruzione dell`albero L`albero e` costruito sulla base della matrice di distanza calcolata nella precedente fase mediante il metodo del Neighbour-Joining. Il Neighbour-Joining e` un metodo per la ricostruzione di alberi filogenetici, e calcola le distanze dei rami nell`albero. In ogni fase i due nodi piu` vicini dell`albero sono scelti e definiti come neighbour (coppia di OTU= operational taxonomic unit che hanno un solo nodo che li connette) Viene prodotto un albero la cui lunghezza dei rami e` proporzionale alla divergenza stimata di ogni ramo. La radice dell`albero viene posizionata nel mezzo del ramo piu` lungo

7 Allineamento progressivo Ogni step consiste nell`allineare due allineamenti esistenti o due sequenze Ordine di clusterizzazione 1->2, 3->4, (3,4)->(1,2), 5->(1,2,3,4)

8 1 P E E K S A V T A L 2 G E E K A A V L A L 3 P A D K T N V K A A 4 A A D K T N V K A A 5 E G E W Q L V L H V 6 A A E K T K I R S A Senza peso delle sequenze Score= M(t,v) + M(t,i) + M(l,v) + M(l,i) + M(k,v) + M(k,i) + M(k,v) + M(k,i) /8 Valore medio della matrice di peso che deriva dal confronto degli aminoacidi nei due set di sequenze Algoritmo di programmazione dinamica. Con peso delle sequenze Score= M(t,v) *W1*W5 + M(t,i) *W1*W6 + M(l,v) *W2*W5 + M(l,i) *W2*W6 + M(k,v) *W3*W5 + M(k,i) *W3*W6 + M(k,v) *W4*W5 + M(k,i) *W4*W6 /8

9 Al fine di compensare un possibile bias rappresentato dalla presenza di una famiglia di proteine, viene ridotto il peso di sequenze correlate 1) Vengono usati i valori del`albero prodotto con il NJ 2) Se due o piu` sequenze condividono lo stesso ramo il valore viene diviso tra le sequenze A 0.2+(0.3/2)= B 0.1+(0.3/2)= C 0.5

10 Gap penalty PENALITA` DI UN RESIDUO SPECIFICO: sono gap penalty che riducono o aumentano la probabilita` di avere un gap per ogni posizione nell`allineamento. Derivano da tabelle che riportano la frequenza relativa di avere un gap adiacente ad ogni amonoacido (Pascarella Argos 1992 J.Mol.Biol) PENALITA` RESIDUI IDROFILICI: aumentano la probabilita` di avere un gap all`interno di un frammento di 5 o piu` aminoacidi idrofilici. Questi probabilmente sono regioni di loop o random coil region dove i gap sono piu` probabili DISTANZA DEI GAP: tende a diminuire la probabilita` che un gap sia troppo vicino ad un altro. GAP END: utile quando non si e` interessati ad allineare le estremita`.

11 G:arancione P: giallo idrofobici:blu ~idrofobici:blu chiaro basici:rosso acidi:porpora idrofilici:verde non conservati: bianco

12 Sequenza consenso Una sequenza consenso e` un modo per rappresentare i ridultati di un allineamento multiplo. Una sequenza consenso mostra quali sono i residui conservati (presenti in tutte le sequenze usate nell`allineamento) e quali invece i residui variabili. Specifici motivi possono avere una funzione regolatoria oppure essere sequenze segnale che ridirigono le proteine o RNA in specifici siti all`interno della cellula. Data l`importanza della funzione di queste sequenze, queste tendono a rimanere conservate durante l`evoluzione.

13 Alcuni modi di indicare le sequenze consenso WebLogo è una risorsa in rete per generare sequenze consenso Consenso esatto GRVQGV--R------A--LG -GWV GRVQG[VI]-[FY]R------A L----GWY GRVQGV--R-6A LG--GWV Consenso con variazioni Consenso con ripetizioni

14 A[CT]N{A} A -> questa simbolo e` sempre presente in questa posizione [CT]-> e` presente una C o una T N-> qualsiasi base (nucleotidi) {A}-> qualsiasi base ad esclusione di una A

15 Sequence logos sono rappresentazioni grafiche di un allineamento multiplo di sequenze. L`altezza totale indica quanto la posizione e` conservata, mentre l`altezza di ogni simbolo ne indica la sua frequenza.

16 Pattern e motivi funzionali In molti casi sequenze di proteine ignote non presentano nessuna similarita` con proteine gia` caratterizzate. Tuttavia e` possibile identificare un particolare cluster di residui che vengono comunemente chiamati come pattern o motivi. Questi motivi rappresentano paticolari regioni strutturali di una proteina importanti per svolgere determinate funzioni, come ad esempio legare il DNA o altre proteine o svolgere attivita` enzimatiche. Queste piccole ma importanti porzioni di una proteina sono sottoposte a forti limiti nel corso dell`evoluzione. L`utilizzo di motivi per determinare la funzione delle proteine rappresenta uno degli strumenti essenziali nello studio e analisi delle sequenze.

17 "In some cases, the structure and function of an unknown protein which is too distantly related to any protein of known structure to detect its affinity by overall sequence alignment may be identified by its possession of a particular cluster of residues types classified as a motifs. The motifs, or templates, or fingerprints, arise because of particular requirements of binding sites that impose very tight constraint on the evolution of portions of a protein sequence Lesk A.M. Computational Molecular Biology, Lesk A.M., Ed., pp17-26, Oxford University Press, Oxford (1988).

18 Nonostante la sequenza di un motivo o pattern sia molto utile, c`e` un numero di famiglie di proteine che a causa della loro estrema divergenza non possono essere identificate. Tipici esempi di domini molto importanti da un punto di vista funzionale sono le globine, le immunoglobuline, i domini SH2 e SH3. In questi domini ci sono solo poche posizioni conservate nella sequenza. Costruire una sequenza consenso a partire da queste porzioni puo` portare o all`incapacita` di riconoscere una grande quentita` di proteine che contengono quel dominio (falsi negativi) oppure a identificare troppe proteine che non contengono quel dominio (falsi positivi). Utilizzo di matrici di peso (profili) rappresenta un metodo piu` sensibile per l`identificazione di queste proteine e di domini funzionali.

19 Pattern: motivi definiti da una sintassi riconducibile a espressioni regolari. Matrici o profili: definite facendo ricorso a matrici posizionali di peso. La sintassi, pur essendo rigorosa, e` molto flessibile.

20 PROSITE Prosite e` un database di profili e pattern importanti da un punto di vista biologico, strutturato in modo tale che mediante l`utilizzo di appropiati programmi permette l`identificazione rapida e attendibile della famiglia (se esiste) a cui appartiene la proteina in esame. Contiene: 1) pattern pubblicati in letteratura. Vengono testati e, nel caso sia necessario, migliorati. 2) pattern nuovi.

21 Studio di una famiglia di proteine (letteratura) Allineamento delle proteine che fanno parte di quella famiglia. Identificazione di regioni funzionali importanti da un punto di vista bilogico: - Siti catalitici enzimatici - Siti di legame di gruppi prostetici - Aminoacidi implicati nel legamee con ioni metallici - Residui di cisteina implicati in formazione di legami disolfuro - Regioni coinvolte nel legame con molecole (ADP/ATP, calcio, DNA) o con altre proteine. La difficolta` sta nell`evitare i pattern falsi.

22 * A L R D F A T H D D F S M T A E A T H D S I E C D Q A A T H E A S Supponiamo di considerare un allineamento parziale di tre sequenze nell`intorno di un residuo di un sito attivo (in questo caso l`istidina) E` possibile cominciare la scansione del database considerando il pattern A-T-H-[DE]. Questo pattern e` piccolo e probabilmente identifichera` molti falsi positivi. Il passo successivo consiste quindi nell`allungare il pattern. Ma in questo caso qualsiasi estensione produce un artefatto in quanto gli aminoacidi hanno caratteristiche diverse e sono presenti solo una volta in una data posizione dell`allineamento. [RTD]-[DAQ]-[FEA]-A-T-H-[DE]

23 Profili o matrici di peso Un profilo e` una matrice di pesi sito specifica per ogni aminoacido e gap. Catturano l`informazione sito-specifica di quanto conservata e` una colonna in un allineamento multiplo, e quali sono i residui piu` comuni. E` possibile testare la similarita` di ogni sequenza (target) con il gruppo di sequenze allineate (probe), allineando il target al profilo. Due aspetti distinguono l`uso dei profili rispetto ai metodi comuni di confronto tra sequenze: Un qualsiasi numero di sequenze puo` essere usato per la costruzione del profilo, permettendo quindi l`utilizzo di una maggiore quantita` di informazione rispetto al metodo dell`allineamento a coppie. Il profilo include le penalita` per l`inserzione o delezione in ogni posizione.

24 Costruzione del profilo Gribskov et al. Profile analysis: detection of distantly related proteins. Proc Natl Acad Sci USA Jul:84(13): Un profilo e` una matrice sito specifica di pesi M(p,a), composta da 21 colonne e N righe (N= lunghezza del probe). La riga p corrisponde ad una posizione nel probe. Le prime 20 colonne di ogni riga rappresentano il punteggio di trovare, in quella posizione del target, uno dei 20 aminoacidi. Una colonna aggiuntiva contiene la penalita` per inserzione o delezione in quella posizione.

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26 Il valore del profilo per un aminoacido a in posizione p e`: 20 M(p,a)= W(p,b)xY(a,b) b=1 Y(a,b)= valore della matrice di sostituzione (es. Dayhoff) W(p,b)=e` un peso per la presenza dell`amminoacido b in posizione p. Il modo piu` semplice per calcolare W(p,b) e`: supponete che l`aminoacido b sia presente n(b,p) volte nella posizione p in N R sequenze probe. Allora W(p,b) puo` essere calcolato come : W(p,b)=n(b,p)/N R

27 In famiglie di sequenze omologhe, inserzioni e delezioni tendono a verificarsi con maggiore frequenza nelle regioni che presentano una struttura secondaria, piuttosto che all`interno di queste. La penalita` delle inserzioni e delezioni viene settata quindi anche sulla base di queste osservazioni. A partire da un profilo e` possibile creare una sequenza consenso che permette di visualizzare l`allineamento della sequenza target con il profilo. Ogni residuo c del consenso e` l`amminoacido che ha il punteggio piu` alto M(p,c) nella matrice. Questo rappresenta l`amminoacido piu` simile da un punto di vista evolutivo a tutti i residui della sequenza probe (l`allineamneto multiplo) per quella posizione, piuttosto che il residuo piu` comune.

28 F K L L S H C L L V F K A F G Q T M F Q Y P I V G Q E L L G F P V V K E A I L K F K V L A A V I A D L E F I S E C I I Q F K L L G N V L V C A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y I profili rappresentano quindi un metodo piu `sensibile e robusto rispetto ai pattern perche` fornisco un peso non solo ai residui trovati in una determinata posizione, ma anche a quelli non ancora trovati. Nell`esempio, nella terza colonna A ha un punteggio inferiore a M, nonostante M non compaia nell`allineamento. Questo perche` M ha caratteristiche fisico-chimiche piu` simili a L,I,V e F.

29 Hidden Markov Model L`Hidden Markov Model e` un modello probabilistico descritto come una serie finita di stati, ogni uno dei quali e` associato ad una distribuzione di probabilita`. Le transizioni attraverso gli stati sono governati da una serie di probabilita` chiamate probabilita` di transizione. Ad ogni stato e` associata anche una probabilita` di emissione, ovverosia ogni stato puo` emettere un output con una certa probabilita`.

30 In questo esempio l`hmm e` costituito da due stati (cerchi) connessi dallo stato di transizione (frecce). Ogni stato emettere un simbolo dell`alfabeto (nell`esempio l`alfabeto e` costituito da 2 lettere) con una certa distribuzione di probabilita` (es. p 1 (a),p 2 (a)).

31 E` conveniente pensare ad un HMM come un modello per generare sequenze. A partire da uno stato iniziale viene scelto un nuovo stato con una certa probabilita` di transizione (ad esempio possiamo rimanere nello stato 1 con probabilita` t 1,1, oppure muoverci allo stato 2 con probabilita` t 1,2 ). Il processo di transizione/emissione viene ripetuto fino a quando non si raggiunge lo stato di fine. Alla fine del processo abbiamo una serie di stati nascosti, hidden, cioe` che non osserviamo, e una sequenza di simboli che invece osserviamo.

32 Dalle espressioni regolari all`hmm Come abbiamo gia` visto l`uso delle espressioni regolari e` un metodo efficiente per cercare alcune famiglie di proteine, ma difficile per altre. Sequenza (improbabile) TGCT--AGG Non distingue A o T A C G e T possono essere presenti piu` di una volta ACAC--ATC Sequenza consenso

33 La probabilita` di emissione di ogni stato e` la frequenza di ogni lettera in quella specifica posizione dell`allineamento. Es. stato 1(prima posizione): A=4/5=0.8, T=1/5=0.2 Dopo la posizione 3, 3 sequenza su 5 hanno un`inserzione di varia lunghezza. Quindi la probabilita` di transizione verso in`inserzione e` 3/5 (0.6), quella di non avere inserzione 2/5 (0.4)

34 Nello stato inserzione, la probabilita` associata all`emissione di ogni lettera e` semplicemente la frequenza dei 4 nucleotidi in questa regione. Quindi: A->1/5, C->2/5, G->1/5, T->1/5. In totale ci sono 5 transizioni totali nello stato di inserzione, e la probabilita` di avere una nuova inserzione e` 2/5 (dopo la prima inserzione, la sequenza 2 a due ulteriori inserzioni), mentre la probabilita` di passare ad un nuovo stato e` 3/5.

35 A questo punto e` facile calcolare il punteggio per la sequenza consenso ACAC ATC. Si calcola moltiplicando la probabilita` di emissione di ogni stato per la probabilita` di transizione ad un` altro stato. P(ACAC ATC)=0.8 x 1 x 0.8 x 1 x 0.8 x 0.6 x 0.4 x 0.6 x 1 x 1 x 0.8 x 1 x 0.8 =4.7x10-2

36 Facendo lo stesso tipo di calcolo si ricava che il punteggio per la sequenza da testare e` x10-2, circa 2000 volte piu` piccolo rispetto al punteggio della sequenza consenso. In questo modo noi possiamo dare un punteggio ad ogni sequenza, un valore che ci dice quanto bene una sequenza si adatta al motivo.

37 Un profilo HMM e` un particolare tipo di HMM che permette di avere gap penalties posizione dipendenti. I quadrati sono chiamati stati principali poiche` modello la colonna degli allineamenti. I rombi sono stati di inserzione e sono usati per modellare le regioni molto variabili dell`allineamento. I cerchi sono stati di delezione. Sono particolari perche` sono silenti, nel senso che non emettono nessun simbolo. (Permettono di saltare tra una o piu` colonne dell`allineamento).

38 Dato un HMM ci sono tre domande fondamentali che ci si puo` porre: 1) con quale probabilita` una sequenza data e` stata generata da un HMM (il problema del punteggio) 2) qual`e` la sequenza di stati ottimale con cui questo HMM ha potuto generare la sequenza? (problema dell`allineamento) 3) dato un allineamento multiplo di sequenze, quali sono la struttura e i parametri di un HMM che lo descrivoo nel modo migliore possibile? (problema dell`allineamento)