Saggi Citotossicità Xenometrix: Principi ed Applicazioni

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1 Saggi Citotossicità Xenometrix: Principi ed Applicazioni

2 Visione d insieme 1. Perchè eseguire un saggio di citotossicità? 2. Quali caratteristiche deve avere un saggio di citotossicità? 3. Quali test offre la Xenometrix? 4. Come funzionano? 5. Perchè un cliente dovrebbe usare i nostri kit? 6. Quali problemi/domande possono presentarsi?

3 Perchè eseguire un saggio di citotossicità? Generalmente: Identificare composti che sono tossici per cellule animali o umane MA:

4 Paracelsus (Theophrastus Bombast von Hohenheim ): "Alle Ding' sind Gift und nichts ohn' Gift; allein die Dosis macht, dass ein Ding kein Gift ist." (Tutte le cose sono velenose e niente è senza veleno; solo la dose rende una cosa un veleno ) NaCl LDlo (human) = 1000 mg/kg Identificare la dose alla quale il composto diventa tossico

5 I test di citotossicità in vitro sono una parte dell informazione per decidere se il composto ha (in vitro) una finestra terapeutica favorevole Activity vs. Cytotoxicity % Inhibition Concentration Activity cpd 1 Activity cpd 2 Activity cpd 3 Cytotoxicity 1 Cytotoxicity 3 Cytotoxicity 2

6 Quali caratteristiche deve avere un saggio di citotossicità? (1) Identificare composti con un profilo attività/tossicità sfavorevole. Alta specificità pochi falsi positivi Alta sensibilità pochi falsi negativi Vantaggi nei test multiparametrici Basso consumo del composto Ragionevolmente veloce, buon output

7 Quali caratteristiche deve avere un saggio di citotossicità? (2) Falsi negativi in alcune condizioni: 5-FU IC50 with different assays Propranolol IC50 with different assays IC50 (um) LDHe XTT NR SRB IC50 (µm) LDHe XTT NR SRB h Overnight 24 h 48 h 0 2 h Overnight 24 h 48 h Exposure time Exposure time

8 Quali caratteristiche deve avere un saggio di citotossicità? (3) Altamente riproducibile Specialmente per laboratori piccoli: Facilmente manipolabile, buon protocollo Prezzo ragionevole Non necessitare di hardware particolari o costosi Risultati chiari, non necessitare di software analitici sofisticati Assistenza al cliente accellente

9 Quali test offre la Xenometrix? Set di test classici Metodi ampiamente accettati Dati pubblicati Kit singoli o combinazioni Kit completamente pronti all uso Reagenti testati qualitativamente Protocolli validati Assistenza gratuita al cliente pre e post vendita

10 NEUTRAL RED - Attività lisosomiale - Permeabilità di membrana LDHe - Permeabilità di membrana ACID PHOSPHATASE - Attività lisosomiale GLUCOSE - Stato fisiologico generale della cellula - Consumo glucosio MTT / XTT -Metabolismo mitocondriale - Tossicità respiratoria SULFORHODAMINE B - Proliferazione cellulare - Tasso sintesi proteine totali CRYSTAL VIOLET -Proliferazione cellulare - DNA

11 Principi del test Saggio Parametri Principi XTT Attività Mitocondriale Il sale di tetrazolio giallo è convertito nel derivato formazano solubile in acqua PAC Attività lisosomiale PAC taglia l incolore nitrophenylphosphate nel giallo nitrophenolate LDH Permeabilità di membrana LDH riduce il piruvato in lattato, si misura il decremento di NADH dovuto all LDH dalle cellule danneggiate

12 Saggio Parametri Principi SRB Sintesi proteine Misurazione quantitativa del colorante SRB che lega le proteine cellulari NR Attività lisosomiale Misurazione quantitativa del NR che lega le cellule vive e si accumula nei lisosomi

13 Quali test offre la Xenometrix? Vantaggi dei kit multiparametrici: Necessità minor quantità cellule (cellule primarie!) Necessità minor quantità composto Aumento sensibilità e specificità Possibile indicazione del meccanismo di azione Kit PAN-1 (XTT/SRB/NR/LDHe): Vincitore del Frost and Sullivan Award 2009 come prodotto innovativo nella scoperta farmaceutica

14 Meccanismo di azione del kit PAN-1 Chloroquine IC50 (µm) h 16 h 24 h 48 h Exposure time LDHe XTT NR SRB

15 Quali test offre la Xenometrix? Vantaggi dei kit multiparametrici: Possibilità di evitare condizioni di interferenza: - composti colorati diverse lunghezze d onda - inibitori enzimatici enzimi alternativi o coloranti - conoscenza incompatibilità, es. composti lisosomotrofici (cloroquina), composti con attività redox (acido ascorbico) - Componenti interferenti dei terreni: FCS, piruvato, rosso fenolo

16 Come funzionano i saggi della Xenometrix? Principi generali: Cellule primarie vengono seminate (in flask o in microtiter) Linee cellulari: se aderenti, le cellule vengono staccate dalla flask con tripsina Le cellule vengono seminate nella microtiter a 96-pozzetti -> le cellult aderiscono La sostanza da testare viene aggiunta (tempo si esposizione: es. overnight/ 24h/ 2giorni) Le microtiter vengono lavate Passaggi specifici del saggio (es. aggiunta reagente che è converito al prodotto colorato) Misurazione alla OD specifica della sostanza colorata

17 Procedure for XTT assay XTT assay Discard supernatant and wash wells with PBS, 200 l/well PBS NR I 1X Discard PBS solution 2 3 Add fresh culture medium 200 l/well NR I Medium Mixture I+II 50 l/well XTT I +II 5 Incubate 2-4 h at 37 C, 5% CO 2 6 OD reading 480

18 Perchè un cliente dovrebbe usare i nostri kit? Controlo qualità dei regenti e protocolli semplici, dettagliati e consolidati Non necessitano di hardware sofisticati e costosi Non è richiesto un software di analisi Assistenza gratutia al cliente prima e dopo la vendita Unici per i kit multiparametrici

19 Domande più comuni dei clienti Perchè non vendete il saggio WST-1/WST-8/MTS/Alamar Blue? Questo saggio è correlato al saggio XTT ( basato sul tetrazolio). Alcuni sono brevetti protetti. Alcuni reclami per avere una sensibilità più elevata o una stabilità migliore. Ma: La maggior parte dei ricercatori non necessitano di un aumento di sensibilità nei loro saggi di citotossicità! Un altro problema è il diverso potenziale redox di questi substrati, ciò significa che possono essere convertiti da altre deidrogenasi oltre che dalla succinato deidrogenasi mitocondriale e questo porta ad una minor proporzionalità con il numero di cellule vitali rispetto XTT.

20 Domande più comuni dei clienti Perchè dovrei usare il saggio LDHe piuttosto che uno della concorrenza? Il nostro saggio è basato su OD340, molti della concorrenza sulla fluorescenza. Questo non è di per se un vantaggio o uno svantaggio; la disponibilità di un lettore di piastre può essere decisiva! Il nostro saggio LDHe misura nella direzione NADH NAD+. Usa un eccesso di piruvato che viene convertito in lattato e quindi non è sensibile al piruvato nel terreno. Alcuni saggi concorrenti funzionano nella direzione opposta e possono essere influenzati dalla presenza di piruvato.

21 Quali problemi o domande possono presentarsi? - Conoscenze base nella tecnica delle colture cellulari, il lavoro in sterilità è indispensabile. - Problemi conosciuti sono discussi sulla homepage nella sezione "Frequently Asked Questions" (FAQ).

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