Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA

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1 Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a Pier Franco Pignatti Lezioni N Mutagenesi e malattie da difetto di riparazione Neri-Genuardi cap. 11 Xeroderma Pigmentoso, Atassia Teleangiectasia, Anemia di Fanconi, S. Bloom, S. Lynch

2 Mutazioni spontanee Avvengono durante la vita normale della cellula, cioè in individui non esposti a mutageni o radiazioni. Costituiscono il materiale usato dalla selezione naturale per l evoluzione biologica. Cause possibili: tautomeria, deaminazione, depurinazione delle basi, radicali liberi, errori replicativi, riparativi o ricombinativi E. Friedberg, DNA Rapair, Freeman 1985

3 Deaminazione Le transizioni C/T rappresentano il 35-50% di tutte le mutazioni puntiformi nell uomo. Il dinucleotide CpG muta per deaminazione 8,5 volte più dell atteso: 5 Me C è hot spot di mutazione (anche C viene deaminata a U, ma il DNA può essere riparato)

4 Mutazioni indotte Mutageni fisici Radiazioni ionizzanti (raggi X, gamma, cosmici, radioattività artificiale e naturale) Radiazioni UV Mutageni chimici Deaminanti, analoghi delle basi, alchilanti, intercalanti, prodotti di pirolisi, sostanze naturali, prodotti sintetici

5 Mutagenesi da raggi X Hartl. Genetica Umana, Zanichelli 1986 (senza frazionamento di dose)

6 Esposizione prenatale alle esplosioni atomiche 8-15 settimane: divisione e migrazione delle cellule nervose nella corteccia cerebrale Curtoni et al, Manuale di Genetica, UTET 1991

7 Effetti dell incidente nucleare di Chernobyl (Aprile 1986)

8 Alcuni mutageni chimici Deaminanti Analoghi delle basi Alchilanti Intercalanti Hartl, Genetica Umana, Zanichelli 1996

9 Mutageni ambientali Sostanze naturali: es. aflatossina Prodotti di pirolisi: es. cibi cotti, tabacco Prodotti sintetici: es. additivi alimentari, cosmetici, tinture permanenti per capelli, farmaci citostatici e immunodepressivi, insetticidi e fungicidi, erbicidi e fitormoni, prodotti per la casa (ipoclorito sodio), il lavoro (cloruro vinile, diossina), nella atmosfera (formaldeide, fumo di sigaretta)

10 Mutageni e cancerogeni Test di mutagenesi di Ames Revertenti his his - Test di Ames per tre tinture di capelli

11 Il costo umano dell uso del tabacco Più di 5 milioni di morti/anno: la prima causa mondiale di morte prematura prevenibile (Mathers CD e Loncar D 2006) NEJM 330:907, 1994

12 Cancro del polmone Il fumo di sigaretta è la causa del 90% dei Ca del polmone. E carcinogeno per la presenza di più di 60 sostanze chimiche che legano e mutagenizzano il DNA. Si formano addotti ingombranti caratteristici alle basi puriniche, come 8-oxoG Dallo studio con Next Generation Sequencing (NGS) del genoma di linee cellulari derivate da un tumore polmonare a piccole cellule (SCLC) si deduce che si forma circa una nuova mutazione ogni 15 sigarette fumate Pleasance ED et al, Nature 2010; Hecht SS, Nature 2011

13 Fumo:il pentimento paga Studio sui rischi del fumo di sigaretta su persone in USA: l attesa di vita è ridotta di più di 10 anni fra i fumatori rispetto ai non fumatori. Smettere di fumare fra 25 e 34 anni di età fa guadagnare 10 anni di vita! Jha P et al, NEJM 2013

14 Fumo. Rapporto Surgeon General Oltre al tumore al polmone, causa altre 40 malattie Solo in America, 20 milioni i morti per il fumo, 8 milioni salvi grazie alla prevenzione. Forti rischi anche dal fumo passivo. Dal 1964, ad esattamente cinquant anni dal primo report scientifico sui danni derivati dal fumo, - intitolato Surgeon General s Reports on Smoking and Tobacco Use sono stati scoperti molti disturbi cui può andare incontro il fumatore, oltre al noto tumore al polmone: a renderne conto è una lunga serie di rapporti del Surgeon General, che hanno fornito fondamenti scientifici all azione diretta alla riduzione dell uso del tabacco, alla prevenzione delle malattie correlate e delle morti premature. Il documento odierno The Health Consequences of Smoking 50 Years of Progress fornisce un dettaglio completo di queste malattie, includendone dieci nuove, a partire dalle conseguenze dirette fino agli effetti di seconda mano, cioè del fumo passivo, sia negli adulti che nei bambini.

15 Let s make the next generation TOBACCO-FREE 7 luglio 2014

16 Conseguenze dei danni del DNA ROS: specie reattive dell ossigeno; IR: radiazioni ionizzanti; ICL: legami crociati interfilamenti; DSB: rotture dei doppi filamenti; CPD: dimeri pirimidinici ciclobutanici; 6,4,-PP: 6,4 fotoprodotti Wolters S e Schumacher B 2013

17 Risposta al danno del DNA (DDR) : danno; a: tolleranza; b: riparazione Friedberg E, Nature 2003

18 Alcune malattie AR da difetto di riparazione del DNA Gruppi di complementazione 8* *XP: 7 proteine NER (Es. gruppo D: DNA elicasi; gruppo E: DNA BP), più la DNA polimerasi eta per TLS

19 Test di complementazione Cellule di un paziente sono trasformate con DNA estratto da un altro paziente. Si esegue un test per determinare il deficit di riparazione del DNA. Si osserva un fenotipo mutato se le mutazioni sono nello stesso gene, oppure il ripristino del fenotipo normale se le mutazioni sono in un altro gene Strachan e Read, Genetica umana molecolare, UTET 2001

20 Xeroderma Pigmentosum (XP) RR Ca cute: x in pazienti XP sotto a 20 anni di età! Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985

21 Difetto di riparazione in cellule XP c.normali irradiate c.xp irradiate Test UDS (sintesi non programmata di DNA): dopo irradiazione UV si nota che in cellule XP non c è sintesi riparativa. Difetto NER in XP. Difetto TLS in XPV, la forma variante di XP (mutazioni di Pol eta, responsabile della sintesi translesione di dimeri pirimidinici ciclobutanici)

22 Malattie con difetto di riparazione e trascrizione 7 malattie del complesso XP-CS-TTD (rettangoli), tutte con ipersensibilità agli UV. Difetti in 11 geni (ovali) Complesso di trascrizione TFIIH che interagisce con componenti del sistema NER Kraemer KH, Nature Genetics 2004

23 Atassia Teleangiectasia (AT) Neurodegenerazione progressiva. La dilatazione anomala dei piccoli vasi sanguigni si osserva facilmente nella congiuntiva. Difetto di risposta alle rotture a doppio filamento del DNA Friedberg, DNA Repair, Freeman 1985

24 Difetto di riparazione in cellule AT Test crescita cellulare Test incorporazione H 3 T Gene ATM (AT-Mutated), sensore del danno al DNA. La inattivazione di questa proteina chinasi produce un difetto nella risposta alle rotture (ds) del DNA Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985

25 Anemia di Fanconi Pancitopenia, difetti scheletrici (aplasia radiale), iperpigmentazione, bassa statura, microftalmia e altri dismorfismi

26 Difetto di riparazione in cellule FA Test del diepossibutano (DEB): si nota instabilità genomica dovuta a un difetto di riparazione dei legami crociati

27 Sindrome di Bloom (BS) Bassa statura, sensibilità alla luce solare, immunodeficenza, instabilità cromosomica, predisposizione ai tumori. Gene BLM: DNA elicasi. Instabilità genomica con aumento della frequenza degli scambi fra cromatidi fratelli

28 Scambio di cromatidi fratelli (SCE) in cellule BS cromosomi arlecchino >5-10x in BS Friedberg E et al DNA repair and mutagenesis, ASM Press 2006

29 Difetti di riparazione in tumori e nell invecchiamento Hoeijmakers JHJ, DNA Damage, Aging and Cancer, NEJM 2009

30 Difetto di riparazione in HNPCC, tumore ereditario non poliposico del colon o S.Lynch H Difetto MMR Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

31 Instabilità dei microsatelliti (MSI o MIN) in HNPCC Il tumore per il marcatore BAT26 ha 1 nuovo allele (doppie frecce) che ha perso circa 5n, per il marcatore D2S123 ha 2 nuovi alleli (triple frecce): uno con perdita di circa 10 n. a sin, uno con aggiunta di 2 n. a destra Lynch HT e A de la Chapelle NEJM 2003

32 Riparazione del DNA e durata della vita Kornberg A, DNA Replication, Freeman 1980

33 Sindromi progeroidi e difetto di riparazione DNA elicasi La durata della vita è diminuita nelle sindromi progeroidi che si manifestano con invecchiamento precoce e insorgenza prematura di malattie solitamente associate con individui molto più anziani: S.Werner (osteoporosi, aterosclerosi, diabete, capelli bianchi), S.Cockayne (cataratta), Trico Tio Distrofia (osteoporosi, cataratta, capelli fragili), AT (immunodeficenza, capelli grigi). Durata media della vita: WS 50 anni, CS 12 anni, TTD 10 anni, AT 20 anni. Tutte malattie con difetto di riparazione