PARASSITISMO. Il parassita utilizza l ospite come nicchia ecologica

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1 PARASSITISMO Simbiosi antagonista in cui il parassita vive a stretto contatto con un altro organismo di specie diversa, l ospite, e trae i suoi mezzi di sussistenza da esso, con beneficio per il parassita e danno per l ospite Il parassita utilizza l ospite come nicchia ecologica

2 MASTIGOPHORA Flagellati PROTOZOI SARCODINA SPOROZOA Amebe Plasmodi etc. CILIOPHORA Ciliati PLATELMINTI TREMATODI CESTODI Schistosoma, Fasciola, etc Vermi piatti, segmentati ELMINTI METAZOI NEMATELMINTI NEMATODI Vermi tondi, non segmentati ARTROPODI

3 Le procedure di parassitologia sono classificate come ad elevata complessità Procedure non automatizzate Riconoscimento in base alle caratteristiche morfologiche Indispensabile la conoscenza da parte dell operatore di: - ciclo - epidemiologia - infettività - diffusione geografica - sintomi clinici - relazione con lo stato immunologico del paziente per i diversi parassiti

4 DIAGNOSTICA PARASSITOLOGICA Le ricerche parassitologiche sono in costante aumento perché aumentano: I viaggi in aree endemiche Gli immigrati da Paesi endemici Gli immunocompromessi Il trasporto accidentale di parassiti

5 benchè le infezioni da parassiti interessino tutto il mondo, la maggior parte di esse si verificano nelle regioni tropicali

6 Dove c è più povertà e assenza di strutture igieniche adeguate

7 La diffusione delle parassitosi è strettamente legata al flusso dei viaggiatori internazionali milioni/anno milioni/anno Che viaggiano per motivi di: Turismo Volontariato Lavoro Studio

8 Negli ultimi anni i grandi movimenti di popolazione sono dovuti principalmente a migrazione, guerre, cataclismi Con nuove masse di popolazioni a rischio infettivologico (migranti, profughi, rifugiati)

9 Gli spostamenti possono avvenire in diverse direzioni: Zone non endemiche Zone endemiche Zone endemiche Zone non endemiche Ma anche i vettori possono viaggiare! Malaria da aeroporto Malaria da valigia

10 I parassiti più frequentemente ricercati in Italia sono: Giardia intestinalis Entamoeba histolytica Cryptosporidium parvum Taenia spp. Enterobius vermicularis Plasmodium spp. Trichomonas vaginalis feci sangue tampone vaginale

11 La produzione di un corretto referto deve cominciare da rigidi criteri di accettazione o di rifiuto del campione clinico Diagnostic Medical Parasitology Lynne S. Garcia Se il campione appropriato non è stato raccolto e trasportato correttamente, l infezione può non essere riconosciuta

12 Accettazione del campione - Parassitologia Per un corretto processamento del campione clinico sono indispensabili specifiche informazioni: Età del paziente Stato immunologico Soggiorni all estero Sintomi clinici Infezioni pregresse Contatto con individui infetti E spesso indispensabile contattare direttamente il medico curante

13 Etichettatura Sul campione devono essere indicati: - nome e cognome del paziente - data e ora del prelievo Nella richiesta devono essere indicati: - Età del paziente - Sospetto clinico - Pregresse parassitosi - Stato immunologico - Terapie in corso - Nome del medico curante

14 SERVIZIO DI PARASSITOLOGIA Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica Dipartimento di Scienze Biomediche ACCETTAZIONE COGNOME E NOME.....ETA CAMPIONE... PROVENIENZA DATA DEL PRELIEVO...ORA DEL PRELIEVO. RESIDENZA*.PROFESSIONE*. PERMANENZA ALL'ESTERO: Località...dal al IMMUNODEPRESSIONE: SI NO PREGRESSE PARASSITOSI... TERAPIA ANTIBIOTICA IN CORSO SOSPETTO CLINICO. Operatore Data

15 Raccolta del campione - feci il contenitore deve essere: - a bocca larga - pulito - asciutto - a tenuta

16 Raccolta del campione - feci 1. Il campione di feci non deve essere raccolto dopo somministrazione di: Bario Antibiotici Antimalarici Olio minerale Antidiarroici non assorbibili Aspettare almeno una settimana 2. Non deve essere contaminato da: Acqua Urine

17 Raccolta del campione - feci 3 campioni nell arco di 10 giorni Un solo campione sensibilità: circa 50% Campioni successivi % G.lamblia E.histolytica 13% 25% 34% 43% 50% Non più di un campione al giorno

18 Raccolta del campione sangue 1. Sangue con anticoagulante (EDTA o eparina) 2. Striscio

19 Raccolta del campione Succo duodenale Deve essere inviato al laboratorio immediatamente Tampone vaginale Con il terreno di trasporto può essere accettato anche entro le 24 ore SOLO SE CONSERVATO A TEMPERATURA AMBIENTE Urine T.vaginalis devono essere inviate al laboratorio immediatamente NON REFRIGERARE S.haematobium entro 24 ore

20 Trasporto del campione - feci Feci diarroiche: entro 30 minuti Feci poltacee: Feci formate: entro 1 ora entro 24 ore

21 Fissazione del campione - Formalina - SAF (sodio acetato, Acido acetico, formalina) - PVA (polyvinil alcohol)

22 Una volta individuato un problema all accettazione.. Accettazione con riserva Campione respinto Comunicazione con il reparto o il medico curante Campione respinto Risoluzione del problema Analisi del campione

23 Esame parassitologico delle feci Esame macroscopico Verranno evidenziati: Consistenza del campione Presenza di muco e/o sangue Presenza di elminti adulti o di parti di essi

24 Esame parassitologico delle feci Esame microscopico A fresco Dopo concentrazione Dopo colorazione permanente

25 Processamento del campione Osservazione microscopica a fresco Preparazione del vetrino: una goccia di soluzione salina una goccia di Lugol Stemperare una piccola quantità di feci con uno stuzzicadenti Coprire ciascuna goccia con un coprioggetto quadrato

26 Processamento del campione Osservazione microscopica a fresco Osservazione al microscopio 100 x 400 x

27 Concentrazione Da feci fissate Migliora la raccolta di cisti, spore, uova Aumenta di 8-10 volte la sensibilità Non si evidenziano i trofozoiti

28 dal sedimento si allestisce un vetrino che si osserva al microscopio

29 Colorazione permanente E forse la tecnica più importante per l identificazione di protozoi intestinali Entamoeba histolytica Entamoeba coli COLORAZIONE TRICROMICA Giardia intestinalis

30 FRESCO 13% 25% 34% 43% 50% FRESCO + CONCENTRAZIONE 21% 38% 51% 61% 69% FRESCO + CONCENTRAZIONE + TRICROMICA 41% 65% 79% 88% 93%

31 Giardia intestinalis Protozoo flagellato Ubiquitario E la causa più frequente di diarrea non batterica in USA Anaerobio facoltativo Non ha mitocondri Si moltiplica per scissione binaria

32 Si trasmette per via oro-fecale

33 Ciclo vitale Il basso ph dello stomaco induce l excistamento I trofozoiti che raggiungono le porzioni distali dell intestino sono indotti dall alto ph e dai sali biliari a trasformarsi in cisti I trofozoiti si dividono per scissione binaria longitudinale

34 TROFOZOITE µm di lunghezza, 7-10 µm di larghezza 8 flagelli disco ventrale adesivo 2 nuclei

35 CISTI Ovale µm di lunghezza, 6-10 µm di larghezza 4 nuclei Parete ben definita spesso staccata dal citoplasma

36 DIAGNOSI Esame microscopico delle feci In caso di negatività si esegue su più campioni Ricerca cisti e trofozoiti Esame microscopico del succo duodenale

37 AMEBE INTESTINALI Molte specie di amebe possono infettare l uomo. Entamoeba histolytica Entamoeba dispar Entamoeba coli Entamoeba hartmanni Endolimax nana Iodamoeba butschlii

38 AMEBE INTESTINALI..ma solo una è patogena Entamoeba histolytica Entamoeba dispar Entamoeba coli Entamoeba hartmanni Endolimax nana Iodamoeba butschlii

39 Entamoeba histolytica E un protozoo, responsabile della dissenteria amebica e dell ascesso amebico Provoca morti/anno E la 2 causa di morbilità e mortalità tra i protozoi parassiti (dopo la malaria)

40 L infezione è diffusa in tutto il mondo, ma è più frequente nelle aree tropicali (America centrale e del Sud, Africa, subcontinente indiano)

41 MORFOLOGIA TROFOZOITE: Anaerobio, senza mitocondri Da sino a µm di diametro Un nucleo con cariosoma centrale Movimento mediante pseudopodi

42 CISTI: forma sferica Da µm di diametro 4 nuclei con cariosoma centrale

43 Esistono due specie di Entamoeba indistinguibili morfologicamente E.histolytica patogena E.dispar non patogena E.dispar è 10 volte più diffusa di E.histolytica * Diamond, L.S. and Clark, C.G. (1993) A redescription of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 (Emended Walker, 1911) separating it from Entamoeba dispar Brumpt, J Eukaryot Microbiol 40,

44 DIAGNOSI Esame microscopico delle feci su più campioni Esame a fresco e dopo concentrazione Colorazione permanente PERMETTE DI DIFFERENZIARE IL GRUPPO E.h./E.d DALLE ALTRE AMEBE INTESTINALI non distingue E.dispar da E.histolytica

45 ELISA su materiale fecale PCR sul campione di feci TIPIZZAZIONE DEGLI ISOENZIMI dopo isolamento DISTINGUONOE.dispar da E.histolytica

46 ESAME MICROSCOPICO Caratteri distintivi delle amebe intestinali DIMENSIONI CISTI DIMENSIONI TROFOZOITI PSEUDOPODI CROMATINA CARIOSOMA NUMERO NUCLEI CISTI E.histolytic a (15-20) UNIDIREZIONALI UNIFORME PICCOLO COMPATTO 4 E.dispar E.coli IN PIU DIREZIONI CONTEMPORANE AMENTE IRREGOLARE ECCENTRICO 8 O PIU E.hartman ni SIMILE A E.h/E.d 4 E.nana I. butschlii SENZA CROMATINA PERIFERICA GRANDE IRREGOLARE 4 1

47 Entamoeba coli Diffusa in tutto il mondo Trofozoiti: µm, cariosoma eccentrico Cisti: µm, sino a 32 nuclei, cariosoma eccentrico

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49 Entamoeba histolytica CISTI

50 Entamoeba coli TROFOZOITI

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52 E.nana E.coli E.hartmanni

53 CRIPTOSPORIDIOSI Il periodo di incubazione varia da 2 a 10 giorni (media 7 giorni) Infezione: da asintomatica a fatale L infezione da C.parvum può provocare: Diarrea acquosa che può essere accompagnata da: Disidratazione perdita di peso Dolori addominali febbre, vomito e diarrea Nell immunocompetente l infezione si risolve generalmente in 1-2 settimane

54 DIAGNOSI Osservazione a fresco Colorazione acid-fast modificata

55 Colorazione Acid fast modificata

56 Immunofluorescenza

57 ENTEROBIUS VERMICULARIS (OSSIURI) L uomo è l unico ospite Colpisce soprattutto i bambini E ubiquitario DIAGNOSI: Scotch test x µm

58 Raccolta del campione scotch test Lo scotch viene posizionato sul vetrino, che fungerà anche da supporto per il prelievo Il laboratorio fornisce il vetrino preparato con lo scotch e una copia del disegno 3 campioni possono essere portati al laboratorio tutti insieme

59 TAENIA SPP. La forma adulta vive nell intestino umano Si distinguono: uno SCOLICE e un COLLO da cui generano le PROGLOTTIDI Le proglottidi più giovani sono le più vicine al collo

60 Verme adulto Lunghezza: 2-3 metri Proglottidi: Può vivere anni

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62 Taenia solium Taenia saginata

63 EPIDEMIOLOGIA - Taenia solium L infestazione da Taenia solium adulta e la cisticercosi sono diffuse soprattutto tra popolazioni a basso livello igienico consumatrici di carne di maiale o cinghiale poco cotta E praticamente sconosciuta nei paesi musulmani In Italia è ormai piuttosto rara EPIDEMIOLOGIA - Taenia saginata E diffusa soprattutto nei paesi dove è elevato il consumo di carne bovina cruda In Italia è presente, con prevalenza piuttosto bassa 100 milioni di casi nel mondo

64 DIAGNOSI L infestazione si evidenzia con l esame microscopico delle feci (non nei primi 3 mesi) Si evidenziano: Larva esacanta UOVA µm PROGLOTTIDI

65 Taenia spp. Polline

66 Trichomonas vaginalis Protozoo parassita obbligato A trasmissione sessuale E RESPONSABILE DELLA PIU DIFFUSA MALATTIA A TRASMISSIONE SESSUALE NON VIRALE 200 milioni di casi/anno nel mondo 7,4 milioni di nuove infezioni all anno nei soli Stati Uniti

67 MORFOLOGIA Tipicamente piriforme Assume una morfologia ameboide quando viene a contatto con le cellule bersaglio

68 Ricerca Trichomonas vaginalis tampone vaginale - Esame a fresco - Esame colturale Esame a fresco Allestire un vetrino stemperando il tampone in una goccia di PBS e osservarlo a 200x e 400x ATTENZIONE ALLE FORME AMEBOIDI!

69 Esame colturale GOLD STANDARD Stemperare il tampone in ml di Diamond s modificato in piastra da 24 pozzetti Incubare a 37 C (5% CO 2 ) Osservare quotidianamente al microscopio invertito per almeno 5 giorni Richiede fino a 7 giorni!

70 Test immunologici Non usati di routine PCR Non usata di routine

71 M.hominis e U.urealyticum in donne con e senza tricomoniasi 80,00 70,00 71,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 5,30 42,00 37,00 con T.vaginalis senza T.vaginalis 0,00 M.hominis U.urealyticum P value <

72 MALARIA LA MALARIA E UN PROBLEMA SANITARIO CHE RIGUARDA IL 40% DELLA POPOLAZIONE MONDIALE (2,4 miliardi di persone) OGNI ANNO NEL MONDO: si registrano 500 milioni di casi di malaria (il 90% nell Africa tropicale) 2-3 milioni di persone muoiono a causa della malaria il 75% di queste sono bambini africani

73 Il 90% dei casi di malaria si verifica nell Africa sub-sahariana

74 Sono colpiti in particolare i bambini sotto i 5 anni OGNI 30 SECONDI UN BAMBINO AFRICANO MUORE DI MALARIA

75 Protozoi appartenenti al genere Plasmodium sono i responsabili della malaria nell uomo Plasmodium falciparum Plasmodium vivax Plasmodium ovale Plasmodium malariae MALARIA

76 Plasmodium è un parassita dixeno L ospite definitivo è una zanzara del genere Anopheles L uomo è l ospite intermedio

77 Meno di 100 SPOROZOITI entrano con la saliva Entro raggiungono il fegato e si moltiplicano Dopo 6-15 gg migliaia di MEROZOITI vengono liberati nel sangue e infettano gli RBC Alcuni plasmodi si differenziano in gametociti

78 MANIFESTAZIONI CLINICHE Il sintomo più caratteristico è la febbre, spesso accompagnata da: brividi cefalea dolori muscolari nausea vomito La puntata febbrile è associata alla rottura degli eritrociti provocata dagli schizonti maturi CON IL PROGREDIRE DELLA MALATTIA LA FEBBRE PUO ASSUMERE LE CARATTERISTICHE DI PAROSSISMO Cold stage brividi, mal di testa Hot stage 2-6 ore febbre alta, vomito, mal di testa etc. Sweating stage 2-4 ore diminuzione della febbre, sudorazione

79 DIAGNOSI L esame microscopico di uno striscio di sangue è la tecnica GOLD STANDARD per la diagnosi di malaria Il sangue periferico va prelevato quando si ha l innalzamento febbrile Si allestiscono due vetrini: Presenza-assenza Goccia spessa Morfologia-identificazione Striscio

80 STRISCIO DI SANGUE le cellule dovranno essere disposte in un unico strato Strisciare una goccia su tutto il vetrino Lasciare asciugare bene FISSARE con metanolo assoluto GOCCIA SPESSA Il campione è concentrato circa volte rispetto allo striscio Stendere una goccia su 1 cm 2 Lasciare asciugare bene NON FISSARE I vetrini vengono quindi colorati con GIEMSA 1:20 per 20 minuti

81 Goccia spessa Striscio

82 RAPID DIAGNOSTIC TEST (dipstick) Si basa sulla determinazione di antigeni del parassita presenti nel sangue di individui infetti