UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA Dipartimento di Fisica e Astronomia Galileo Galilei LAUREA MAGISTRALE IN FISICA Attrazione dinamica di batteri alle superfici Relatore: Prof. Giampaolo Mistura Correlatore: Dott. Matteo Pierno Laureando: Enrico Chiarello Anno Accademico 2012/2013

2 Indice v 1 Active Matter Modello di Vicsek Stormi di uccelli Metallic Rods Batteri Motilità: Run e Tumble Confinamento: Accumulo alle pareti Esperimento di Berke et al Parte sperimentale Materiale biologico Preparazione campione Acquisizione immagini Microscopio Modalità di acquisizione Problematiche Analisi immagini Cenni generali Threshold Operazioni morfologiche Connected-Component Labeling Background Subtraction Software Risultati Percoll Misure al variare della distanza Conclusioni 49 iii

3 iv INDICE Bibliografia 51

4 Tutti noi, almeno una volta, ci siamo fermati ad ammirare uno stormo di uccelli librarsi in aria e cambiare vorticosamente direzione come una massa fluida. Di fronte ad uno spettacolo del genere viene spontaneo porsi delle domande, su come sia possibile che un gruppo di individui sia in grado di formare un organismo così coeso e perfettamente coordinato, che sembra quasi possedere vita propria. La risposta a questo genere di domande va cercata nel più generale campo della Active Matter. Con il termine Active Matter (materia attiva) si indica un sistema formato da molti individui simili o identici, in grado di muoversi autonomamente, che possiedano cioè un qualche sistema di propulsione. Questi individui, presi singolarmente, esibiscono un certo comportamento, ma una volta insieme possono assumere un comportamento collettivo completamente diverso. Alcuni esempi più intuitivi di active matter comprendono, oltre ai già menzionati stormi di uccelli (Fig.1a): stormi di insetti, colonie di formiche, stormi di locuste, banchi di pesci (Fig.1b), colonie di batteri (Fig.3), mandrie, gruppi di umani. (a) È da notare che il comportamento collettivo della Active Matter non è una prerogativa dei soli esseri viventi. Il moto collettivo infatti può essere emergente anche in sistemi inorganici. Uno degli esempi più semplici consiste in particelle micrometriche di AgCl (cloruro di argento) sospese in acqua deionizzata, e sottoposte a radiazione UV. La natura asimmetrica della fotodecomposizione di queste particelle (b) Figura 1: Esempi di Active Matter. a) Uno spettacolare stormo di uccelli di grandi dimensioni. b) Un banco di pesci. comporta la loro propulsione in una direzione preferenziale, mentre le interazioni tra gli ioni così generati sono responsabili di fenomeni di moto collettivo. Altri esempi di sistemi non viventi possono essere filamenti di actina deposti su un vetrino cosparso di motori molecolari (Fig.2), oppure piccoli oggetti di varia forma come v

5 vi sferette metalliche o bastoncini deposti su una superficie vibrante. Molti di questi sistemi di active matter sono stati recentemente oggetto di studio e sono stati osservati una grande varietà di fenomeni. Tuttavia, lo studio dei sistemi viventi comporta spesso tutta una serie di difficoltà tecniche e sperimentali. Ad esempio, per ovvi motivi, non è possibile studiare uno stormo di uccelli in laboratorio, ma occorre organizzare spedizioni sul campo e l acquisizione di nuovi dati sperimentali può richiedere molto tempo e risorse, oltre che una certa dose di fortuna. Oltre alla difficoltà di condurre le misure e riprodurre i risultati, è da notare che può essere inoltre difficile o impossibile perturbare il sistema, e cambiare arbitrariamente i suoi parametri. Occorre quindi accontentarsi di osservare gli eventi che offre la natura. Figura 2: Esempio di Active Matter inorganica. Su un vetrino sono fissati dei motori molecolari. Su di essi sono depositati dei filamenti di actina liberi di muoversi. Una frazione di questi sono fluorescenti e possono essere osservati al microscopio. A basse densità di filamenti il moto è disordinato, ma ad alte densità si osservano strutture complesse, come onde e vortici. Per quanto riguarda invece i sistemi non viventi come quelli fisico-chimici menzionati, lo studio sistematico delle loro proprietà è sicuramente più facile ed economico (poiché condotto in laboratorio). Tuttavia, l intrinseca semplicità di questi sistemi spesso comporta che ci siano pochi gradi di libertà su cui agire, e questo può essere un fattore limitante per l interesse nel loro studio. Uno dei sistemi di active matter più promettenti è quello dei batteri, delle alghe o di altri organismi semplici. Questi infatti, oltre a manifestare una ricca fenomenologia di comportamento collettivo, possiedono alcune caratteristiche che li rendono particolarmente adatti allo studio in laboratorio, in particolare: possono essere coltivati in tempi brevi e con poche risorse, e questo consente di ripetere gli esperimenti un numero arbitrario di volte, in condizioni strettamente controllate; alcuni di questi organismi sono stati studiati in maniera estremamente approfondita, come ad esempio il batterio Escherichia Coli, di cui in letteratura si conosce praticamente tutto; possono essere variati numerosi parametri, intervenendo sulla composizione chimica e la geometria dell ambiente in cui si trovano questi organismi, oppure addirittura è possibile intervenire a livello genetico, ad esempio ini-

6 vii bendo l espressione di un particolare gene responsabile di un determinato comportamento. L argomento di questa tesi verte proprio su questa classe di sistemi di active matter. La tesi è stata svolta presso il Laboratorio della Fisica delle Superfici ed Interfacce (LaFSI) del Dipartimento di Fisica e Astronomia. In questo laboratorio si è maturata una notevole esperienza nel campo della microfluidica, che coinvolge la realizzazione di dispositivi microscopici che permettono la manipolazione di fluidi in maniera estremamente precisa e controllata. Nel LaFSI i fluidi più comunemente utilizzati sono acqua, olio, ed emulsioni di essi, e l attenzione è solitamente rivolta alle proprietà interfacciali dei dispositivi microfluidici. La microfluidica sembra essere uno strumento molto potente per lo studio della active matter, in particolare per soluzioni batteriche, poiché consente di controllare la geometria del sistema a livello microscopico, su una scala paragonabile a quella degli elementi costituenti la active matter stessa. Per fare un esempio, si potrebbero studiare gli effetti che ha il confinamento geometrico sulla proliferazione di Figura 3: Impressionante formazione di strutture in una colonia di batteri Bacillus Subtilis del tipo vortex. Gli oggetti scuri sono ammassi di migliaia di batteri che si muovono collettivamente durante la crescita della colonia Figura 4: I batteri motili come l Escherichia Coli sono un perfetto esempio di Active Matter. un infezione batterica all interno dei capillari del sistema circolatorio di un animale. Nel LaFSI lo studio di materiale biologico è però una novità, e pertanto prima di addentrarsi in una tale complessità, occorre prima prendere dimestichezza con la materia vivente e con tutte le difficoltà tecniche e sperimentali che questa comporta. Per fare questo è stato riprodotto un esperimento in letteratura[5] in cui una goccia di una soluzione contenente batteri di Escherichia Coli viene confinata tra due vetrini da microscopio, separati da una distanza fissata dell ordine di un centinaio di micron. È noto infatti già dal 1960 che organismi motili come spermatozoi, batteri e alghe abbiano la tendenza ad accumularsi in prossimità delle due superfici interne dei vetrini. Nell esperimento di Berke viene confermato questo fenomeno con delle misure più precise e ne viene data una interpretazione teorica idrodinamica. L esperimento consiste essenzialmente nella misura del profilo di densità dei batteri al variare della posizione tra i due vetrini. Quello che si osserva è che, mentre nel mezzo del contenitore la densità è pressoché uniforme, a pochi micron di distanza da ognuno dei vetrini la densità è più elevata. In questo lavoro di tesi sono stati riprodotti i risultati di Berke, con un apparato

7 viii sperimentale simile, ed è stato poi cominciato uno studio più sistematico, in particolare variando la distanza tra i due vetrini. Sebbene questo esperimento sembra essere piuttosto semplice, vedremo che esso pone molte difficoltà tecniche sotto vari aspetti. Nel capitolo 1 verrà brevemente introdotta la active matter e saranno illustrati alcuni dei risultati sperimentali più interessanti in letteratura. Nel capitolo 2 verrà trattata la parte sperimentale, che comprende la coltura dei batteri, la preparazione del campione, l apparato di acquisizione delle immagini, il software di analisi delle immagini per il conteggio dei batteri. Seguono poi i risultati e le conclusioni.