LEZIONE 8 Prof Maione 17/10/2017 TRASMISSIONE GLUTAMMATERGICA, GABAERGICA E GLICINA

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1 LEZIONE 8 Prof Maione 17/10/2017 TRASMISSIONE GLUTAMMATERGICA, GABAERGICA E GLICINA Ci sono delle sostanze, degli amminoacidi in realtà, che rientrano nel sistema metabolico, nel sistema bioenergetico(ciclo di Krebs). Sono importanti perché sono dei neurotrasmettitori, rispecchiano una serie di canoni che ci permettono di considerarli come tali, infatti sono sintetizzati e metabolizzati, depositati in delle vescicole, per cui c è un release sinaptico, un processo di uptake (che può esserci o non esserci), un binding con un recettore specifico o una serie di recettori e risposte funzionali, una volta che il recettore si è legato al trasmettitore. I farmaci possono andare ad interferire su questo legame. Tutto ciò è uno stereotipo della farmacologia, può esserci come non esserci (es. release sinaptico o deposito pre-sinaptico). Ad esempio le prostaglandine vengono prodotte on demand (quando servono) dalla membrana e poi agiscono localmente quindi non sono presenti sotto forma di deposito. Parliamo del glutammato, non viene rilasciato da solo ma è spesso co-released, co-rilasciato con altri neurotrasmettitori, come neuropeptidi (sostanza P, fattore neurotrofico o brain-derived neurotrophic factor), oppure altre sostanze,come amminoacidi. Considerando le esigenze del circuito neurale, possiamo avere un cocktail di trasmettitori rilasciati, diverse composizioni di queste vescicole a seconda di quello che serve al momento, pertanto avviene una sommatoria di eventi post-sinaptici che determineranno una sinergia di eventi intracellulari post-recettoriali per cui si attiverà la trascrizione genica o una proliferazione sinaptica. Se è un fenomeno transitorio, a rapida trasmissione, viene rilasciato il glutammato che si lega al suo recettore; diversamente se c è un input di un certo tipo, una stimolazione tetanica quindi c è molta attività a livello pre-sinaptico, succederà qualcosa di diverso sul post-sinaptico. Il glutammato è un acido carbossilico, con un processo di decarbossilazione si forma il GABA, con funzione inibitoria; mentre il glutammato è a trasmissione eccitatoria, è una sostanza che quando è rilasciata serve a trasmettere un segnale di attivazione (on), il GABA,invece, dà un segnale di off, di spegnimento, è un freno delle reti neurali,ovvero del sistema nervoso centrale. Nel caso di un segnale eccitatorio, si ottiene un potenziale post-sinaptico eccitatorio, per cui entra una carica positiva che può essere sodio, calcio ecc., una volta entrata nella cellula attraverso il recettore, stimolato dal glutammato, si ha un transitorio ingresso di cariche positive. Al contrario se ad entrare è il cloro, attraverso GABA-recettori, avviene il fenomeno opposto, si ha un potenziale di membrana pari a -70 mv. IPSP, significa potenziale post-sinaptico inibitorio, iperpolarizzazione poiché la depolarizzazione è inefficace per scatenare lo spike, perché non si raggiunge un potenziale soglia (threshold), garantito dal sodio. I canali del sodio sono quelli che determinano il trigger (scatto), il tutto o niente, perché hanno una struttura interna fatta di un quarto segmento, caricato positivamente, che normalmente è tirato dentro (in site), sul versante intracellulare poiché viene attratto dalle cariche negative presenti in quest ultimo, quindi il potenziale risulta essere fisiologicamente negativo. Se entrano ancora cariche negative all interno della cellula, si ha un iperpolarizzazione transitoria poiché il recettore funziona per alcuni millisecondi, lo stesso se entrano cariche positive, però in questo caso il potenziale cambia, da negativo a positivo, si ha una deviazione verso la positività di questo segnale bioelettrico. Per cui quando arriva l onda di depolarizzazione, questo fronte d onda determina un cambiamento transitorio, di aumento di cariche positive che spingeranno in alto le strutture dei canali del sodio, è un fenomeno che dura 0.3 millisecondi, ma in quel momento entra il sodio e poi subito i segmenti del canale crollano giù, quindi questo crea una distorsione, un periodo refrattario e si crea quest allosteria in quanto vi è un cambiamento di struttura rispetto a quella acquisita durante la cinetica di apertura. Tutto

2 ciò dura poco, per cui il fronte d onda determina l apertura dei canali che stanno dopo,ovvero la componente di canali che era dietro, i quali, dopo il periodo di refrattarietà, tornano normali e ciò garantisce un processo monodirezionale, lineare. Uno spike dipende dalla convergenza di eventi inibitori ed eccitatori che si rilevano con microelettrodi di registrazione; possiamo avere questa soglia in cui tutti i canali del sodio si sono aperti in sincronia, determinando una corrente di entrata di cariche positive, in maniera transitoria, dopo circa 1 millisecondo avviene un processo di desensitizzazione di tutti i canali che hanno contribuito alla fase ascendente, per cui essi poi detteranno l evento successivo della discesa o ripolarizzazione. Quindi avremo un insieme di fenomeni eccitatori che convergono raggiungendo in questo modo un livello sufficiente di apertura e di accumulo di cariche positive. Per quanto concerne l acido glutammico, i recettori del glutammato sono di diverso tipo, possono essere metabotropici o ionotropici. Questi ultimi sono dei recettori canale (usano un trasmettitore precostituito), il legame con il ligando che può essere, in questo caso, l acido glutammico, determina un cambiamento conformazionale del recettore che, transitoriamente, si apre e si richiude quindi hanno una cinetica rapidissima a differenza dei metabotropici. Tra i recettori ionotropici, i più importanti sono i recettori NMDA (N-metil-D-aspartato) ed AMPA,implicati nelle patologie neurologiche, poi ci sono quelli del kainato che ricoprono un ruolo meno rilevante. Questo sistema recettoriale è molto controllato, poiché un iperfunzione del recettore può creare problemi, determina delle alterazioni; la sinapsi eccitatoria, cosiddetta asimmetrica, presenta una serie di strutture complesse che ne regolano il funzionamento. Preferenzialmente gli ionotropici sono localizzati sul terminale post-sinaptico e sono centrali alla sinapsi, i recettori metabotropici, invece, sono perisinaptici, quindi al confine della sinapsi. Pertanto, i primi recettori ad essere coinvolti in una normale trasmissione eccitatoria, sono quelli centrali, ionotropici di tipo AMPA. Gli NMDA sono chiamati in causa più tardivamente, in caso di necessità. I metabotropici,invece, che sono recettori accoppiati a proteine G, possono avere paradossalmente anche una funzione inibitoria. La funzione di un trasmettitore, quindi, dipende dal recettore, ad esempio la dopamina può avere un effetto sia inibitorio che eccitatorio a seconda del recettore a cui si lega. Per tale motivo dire che è il glutammato è un trasmettitore esclusivamente eccitatorio non è del tutto corretto, l azione varia a seconda del recettore che lega. Questo non è valido per i recettori ionotropici, AMPA e NMDA che sono sempre eccitatori, mentre tra i metabotropici alcuni sono accoppiati a Gs, altri a Gi. Se prevale la fase eccitatoria c è una mobilitazione di cariche positive all interno della cellula (es.calcio), viceversa un entrata cospicua di anioni (cloro, bicarbonato), determina un iperpolarizzazione. Perché è importante considerare anche la composizione del recettore? Perché i farmaci ne determinano un cambiamento quando vengono somministrati, avviene un adattamento biologico e pertanto il recettore esprime altre subunità. Guardando l albero filogenetico è possibile seguire l evoluzione dei recettori ionotropici del glutammato; si possono assemblare insieme al NR1 diverse varianti quali 2B, 2A ecc. a formare una struttura tetramerica, quindi quattro subunità formano l omo o eterotetramero ed un canale centrale che consente l ingresso degli ioni. La fisiologia del recettore non è indifferente alla sua composizione, l adattamento avviene a seconda del farmaco applicato ad esempio, per controllare la supereccitazione, conseguente ad un fenomeno di eccitotossicità, presente in molte patologie neurodegenerative. NR1 è la componente fissa, senza cui non possono aggregarsi le altre 3 strutture. Ad oggi è possibile fare la registrazione del singolo canale(single channel recording), ovvero si misura la durata di chiusura ed apertura del canale,quante volte si apre(frequenza) e la quantità di corrente che vi passa in quel frangente di tempo, servendosi del patch clamp. Quindi la cinetica complessivamente cambia a seconda della composizione, perché se ci sta 2A è una cosa, se ci sta 2B è diversa, perché la quantità di corrente che passa è minore e la durata di apertura è inferiore. Magari la frequenza aumenta ma nel contempo si riducono un altra serie di parametri come la quantità di corrente che può passare in un lasso di tempo attraverso lo stesso canale. Quindi a seconda di come è

3 fatto un recettore possiamo avere diverse fisiologie. Se andiamo a vedere quanto resta aperto il canale( la cinetica di desensitizzazione ), risulterà che c è una rapidissima desensitizzazione, cioè si apre e si chiude subito, invece il 2D evidentemente non può stare aperto troppo a lungo perché passerebbe troppa corrente; quelli che hanno una cinetica minore, restano per un tempo più lungo, hanno una chiusura spontanea. Il recettore ha una struttura complessa, presenta molti siti accessori di modulazione, può essere anche fosforilato per cui aumenta anche la sua conduttanza ionica, ma quello che bisogna sapere è che ci sono siti di modulazione accessoria. I recettori possono essere voltaggio dipendenti: canali del Na+, Ca++, K + voltaggio dipendenti, però poi sono influenzati dalla fosforilazione e quindi anche i trasmettitori Kir possono interferire indirettamente sulla fisiologia, sul funzionamento dei canali ionici. Ci sono poi dei recettori che sono un po ibridi, non si accontentano del trasmettitore, ma necessitano anche di una destabilizzazione elettrica della membrana per poter funzionare e questo è appunto il caso del NMDA, un recettore complesso, ma non solo questo, non si accontenta solo dell acido glutammico, ma necessita anche per esempio della glicina. Ci sono dei siti di modulazione accessori che consentono al glutammato di essere attivato, da solo il glutammato non può fare nulla. Quindi c è bisogno di due coagonisti, per cui risulta adesso anche relativo parlare del recettore del glutammato, perché potrei pensare si tratti del recettore della glicina e che è il glutammato che viene in aiuto, perché questa molecola, N-metil-d aspartato è quella che ha consentito la sua caratterizzazione per cui ha preso il nome di recettore N-metil-d aspartato. Quando è stato identificato il sito delle poliammine, dicendo che erano due recettori, non uno, perché a seconda delle patologie possono fare cose interessanti.? Se io metto sugli assi cartesiani x-y da una parte la corrente, perché io ho un singolo canale che si apre e si chiude, posso ad un certo punto manipolare artificialmente lo strato di membrana: da una situazione di riposo -80mV, lo posso portare allo 0 o addirittura renderlo positivo +10 con degli step, per vedere cosa succede a questo recettore, se aumenta, se si riduce, se si blocca, a prescindere dalla presenza del glutammato, in maniera acellulare. Quindi la voltaggio dipendenza di questo recettore è confermata proprio da questa tecnica, perché si può manipolare artificialmente il potenziale e vedere che un massimo di conduttanza in entrata, 1 na, o 1,5nA è il massimo di conduttanza e si verifica più o meno a -40 mv, -30 mv, per cui nella membrana a riposo, in questo canale anche se c è molto nmda,si apre poco, perché non gli basta il trasmettitore, la chimica, c è bisogno anche della depolarizzazione, c è bisogno anche del potenziale destabilizzato e parzialmente depolarizzato della membrana, altrimenti la corrente non passa efficientemente. Però se si continua a depolarizzare qui non avrò più l efficienza mantenuta com era prima, cioè a -20 il canale si apre meno, a -10 mv, quindi depolarizzato praticamente, il canale si chiude direttamente e poi rettifica cioè porta fuori le cariche positive perché diviene troppo positivo ed inizia a funzionare al contrario, i canali del potassio sono canali rettificatori. Questo è molto simile a quello che succede al canale Na, perché si aprono tutti insieme i canali del Na? Perché sono sensibili a questo vertice, a -40 mv c è il massimo di conduttanza perciò sono voltaggio dipendenti. Non si aprono autonomamente ma devono essere perturbati. Quindi la corrente è nmda magnesio dipendente perché se viene applicato ad esempio questo farmaco in presenza di magnesio, questo è il massimo che si può ottenere, ma la cosa interessante è che se si toglie il magnesio da questa soluzione, a parità di concentrazione si ha un potenziamento enorme della corrente, quindi voltaggio dipendente, magnesio dipendente. In altre parole questo canale presenta un sito del magnesio all interno che funge da tappo perché deve controllare il recettore. Questo è un recettore molto importante perché molte patologie neurologiche di tipo degenerativo o malattie psichiatriche derivano da una disfunzione o da un processo maladattativo della modulazione di questo recettore ionotropico : per un fatto genico, come una canalopatia

4 geneticamente determinata o per un problema legato ad un processo di modulazione, questi siti accessori non funzionano bene. Questo fa si che deve essere un canale molto controllato. In condizioni normali non funziona tanto, funziona soprattutto la pompa, cioè il canale della sinapsi e poi anche i metabotropi ecc, il glutammato poi diffonde a livello perisinaptico ed attiva anche questi recettori metabotropi. Però, poiché al centro della sinapsi ci sono soprattutto ionotropi, trova soprattutto nmda. NMDA è un recettore pigro, lento, un po come i canali del calcio, che sono più lenti rispetto al sodio, perché quest ultimi si aprono a -40 mv, mentre il calcio a mv, quindi il canale del calcio per potersi aprire ha bisogno di una situazione favorevole, di una già avvenuta depolarizzazione, di una positivizzazione intracellulare, allora a quel punto il calcio contribuisce a perpetrare il mantenimento della positività intracellulare. Se immaginiamo uno spike neurale sodico, abbiamo un fenomeno rapidissimo, avviene in 5-6 millisecondi, tant è vero che se vedete una registrazione normale sull oscillloscopio, non avete neanche il tempo di vederlo: un canale esaurisce apertura, desensitizzazione e normalizzazione in un millisecondo. Per cui questi milioni di canali del sodio che si aprono all unisono a -40 mv, in sincronia, danno quest ascesa rapidissima ed una discesa altrettanto rapidissima che coincide appunto con il periodo refrattario di desensitizzazione di tutti questi canali. Se registrate uno spike della cellula cardiaca, sale ma poi c è un plateau e poi scende, questo accade perché quel Ca++ che mantiene la depolarizzazione da -70 mv passa a + 20, livello a cui si aprono i canali del calcio, continua per un tempo lunghissimo 300 millisecondi (da un punto di vista elettrofisiologico è un eternità). Il sodio sale e scende in 2-3 millisecondi ma poi chiama in causa il calcio di cui necessita per l accoppiamento elettromeccanico, perché ci deve essere necessariamente il Ca++ per far si che troponina C, ecc.. lo leghino e quindi il sistema actino-miosinico possa determinare la contrazione. Quindi accoppiamento elettrico e meccanico. Come si fa a ritornare alla ripolarizzazione, quindi in condizioni normali? Il Ca non rientra subito, ma interviene il potassio. Quindi il canale reazionario o anche rettificatore in uscita, porta fuori cariche positive, compensa questo accumulo di calcio, che però nell arco di pochi millisecondi altre pompe provvederanno a portare fuori. Ovviamente il glutammato può essere chiamato in causa quando diventa necessario, cioè quando deve cambiare qualche cosa a livello della sinapsi per molto tempo, quando deve intervenire il calcio in maniera sufficiente per cui si hanno delle importanti modificazioni a lungo termine, come ad esempio il potenziamento a lungo termine della sinapsi. In altre parole ad esempio quando io stasera andrò a casa, ricorderò solo alcune cose della giornata, avrò particolarmente delle memorie, questo avviene perché si sono attivati questi recettori nmda, c è stata una tale attivazione, per cui persistentemente nell ippocampo, in alcune regioni della corteccia ecc, che sono preposte alla memoria, avviene che il glutammato viene rilasciato per un bel po di tempo e quindi questo Na,che entra soprattutto,crea una depolarizzazione della membrana che non consentirà più al magnesio del NMDA recettore di permanere in maniera indifferente per molto tempo: si crea una condizione di destabilizzazione per cui elettricamente questo tappo verrà spinto fuori. La voltaggio-dipendenza è questo, ovvero il magnesio sarà cacciato via solamente quando per molto tempo resterà destabilizzata la membrana dall AMPA: l iniziatore di tutta questa storia è l ampa. Quindi quando avviene un fatto particolare, c è il rilascio di molto glutammato, che ha attivato a sua volta per molto tempo gli AMPA, si è creato per un tempo sufficiente una destabilizzazione, depolarizzazione, per cui il magnesio non si trova più elettricamente a suo agio in quel sito e viene liberato: azione permissiva. Il recettore NMDA viene attivato ed è accoppiato ad una serie di fenomeni di trascrizione genica, crea una serie di cambiamenti persistenti, plasticità neuronale. Per cui se io blocco il recettore nmda con i farmaci creo una sorta di demenza, perciò questi farmaci non si possono ancora usare, perché non si riesce a scindere l azione trofica dall azione patologica: entrambi i fenomeni sono regolati, sia la plasticità necessaria per il buon funzionamento cerebrale sia la plasticità patologica che sempre è governata da un

5 eccessivo reclutamento di nmda. Si può avere una patologica schizoide, una forma psicotica dovuta ad un eccessiva attivazione glutammatergica in alcuni distretti della corteccia, allora potrei pensare di bloccare il glutammato, ma non posso inibirlo selettivamente, perché lo bloccherei ovunque. Non possiamo operare ancora con una target therapy, ma capiamo l importanza di questo sistema, perché sappiamo che la fisiologia della memoria e dell apprendimento è governata da questo sistema glutammatergico. In conclusione i meccanismi del potenziamento a lungo termine della trasmissione sinaptica avvengono in questo modo: in condizioni normali prima dell evento che può determinare la depolarizzazione, abbiamo che l acido glutammico funziona soprattutto attraverso gli AMPA, quindi una depolarizzazione normale breve che serve per la normale funzione eccitatoria. Quando si verifica una condizione di stress o patologica, come il tetano, nel cervello molto glutammato viene rilasciato, viene tolto il blocco del magnesio, quindi NMDA è attivato con la trasduzione del segnale, per cui alla fine si ha l attivazione dei recettori AMPA. Vengono portati molti più recettori AMPA in superficie in quanto c è un comando, quindi dopo che ho appreso, memorizzato un fatto, c è un cambiamento strutturale della sinapsi, perché a parità di challenge lo stimolo iniziale che mi dava solo un tipo di risposta sarà seguito da un potenziamento di quel circuito. Quindi la memoria è conservata nei circuiti neuronali che sono potenziati. Finché resta attivato il circuito, si ha la memoria, perdiamo la memoria di un fatto quando quel circuito non è più attivo, automaticamente si spegne, si riduce, ritorna ad altre condizioni. La base neuroanatomica della coscienza, della cognitività e della capacità di sintesi è dovuta a tanti meccanismi, uno dei più importanti è tutto questo. Quando questo recettore non funziona più adeguatamente c è la perturbazione della sua fisiologia, c è una condizione fisiopatologica ed insorgono le malattie psichiatriche e neurologiche.