qpcr, diagnosi di più patogeni nella stessa analisi

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1 582 ALLEVAMENTI ESAMINATI NEL 2017 E CONFRONTO CON IL 2002 qpcr, diagnosi di più patogeni nella stessa analisi di Lucio Zanini, Alfonso Zecconi La produzione quanti-qualitativa di latte si basa su tre pilastri: riproduzione, benessere animale e sanità dell allevamento. La riproduzione è il motore che regola il ciclo produttivo della vacca; infatti, solo con un costante ed efficiente tasso di gravidanza della mandria si possono ottenere alte produzioni sfruttando il naturale picco della montata lattea. Il benessere animale comprende un adeguata alimentazione, spazi non coercitivi per la bovina, che le permettano di produrre in un ambiente adeguatamente pulito e un raffrescamento efficace che aiuti a superare i momenti critici estivi. Terzo pilastro è la sanità dell allevamento, il che comprende una serie di patologie infettive e non, ma tra tutte queste, la mastite, rimane la patologia che incide maggiormente sull economia dell azienda da latte causando notevoli perdite o, nella migliore delle ipotesi, mancati guadagni per l allevatore. Le cause di mastite si possono suddividere in due categorie principali, quelle dovute a batteri che generalmente sono presenti nell ambiente ma che non vivono a lungo in mammella (batteri ambientali) e quelle dovute a batteri che se s instaurano in mammella e si trasmettono da vacca a vacca tramite l impianto di mungitura (batteri contagiosi) (Zecconi et al. 2010; Sangiorgi et al. 2014). Questa differenziazione è importante perché se nel primo caso, una corretta gestione I numeri lombardi euro le perdite annue per azienda in presenza di S. aureus 55 % degli allevamenti con infezioni da batteri contagiosi 2,6 kg di latte/giorno/capo la perdita produttiva negli allevamenti con S. agalactiae cellule/ml negli allevamenti con S. agalactiae 12 supplemento a L Informatore Agrario 27-28/2018 La metodica analitica della qpcr è molto pratica e con esiti in tempi brevissimi per diversi patogeni anche di difficile diagnosi, ha una sensibilità pari o superiore a quella dei metodi convenzionali e può essere effettuata con campioni di latte con conservante e senza l obbligo di una catena del freddo igienica a livello di stabulazione e di mungitura, l incidenza d infezione rimane a livelli contenuti, nel caso di agenti contagiosi la sola gestione igienica non basta. Com è la sanità degli allevamenti in Lombardia Per capire la prevalenza degli agenti mastitogeni contagiosi presenti in Le cause di mastite sono: batteri dell ambiente che non vivono a lungo nella mammella e batteri che si instaurano in mammella e si trasmettono da vacca a vacca tramite impianto di mungitura Lombardia il SATA, in collaborazione con Alfonso Zecconi (Dipartimento di medicina veterinaria dell Università di Milano) ha effettuato due indagini epidemiologiche, la prima nel 2002 (Piccinini et al. 2003) e la seconda nel La prima indagine si è basata sull analisi batteriologica del latte di massa effettuata per la ricerca di agenti contagiosi quali Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus con metodi convenzionali. Al fine di ridurre la numerosità degli

2 TABELLA 1 - Produzione, conteggio cellulare e dimensioni allevamento in base all esito dell analisi con qpcr Patogeno Produzione Contenuto annuo Dimensione allevamento (kg/anno) cellule somatiche (n.) (n. capi/anno) Negativo 30, S. aureus 28, S. agalactiae 27, Prototheca spp. 29, Mycoplasma spp. 30, Si evidenzia la perdita produttiva dovuta al riscontro di agenti patogeni individuati nel latte di massa. allevamenti, senza perdere significatività sulla produzione totale lombarda, le aziende interessate all indagine dovevano avere più di trenta vacche mediamente presenti in allevamento e un Linear score medio annuo compreso tra 2,6 e 4,6 ed essere aderenti ai controlli funzionali. Il protocollo prevedeva il prelievo di un campione del latte di massa ripetuto tre volte nell arco di 10 giorni congelato e inviato al laboratorio tramite la rete organizzativa dei controlli funzionali. Al termine dell indagine erano disponibili dati per un totale di aziende. La seconda indagine si è svolta nel 2017 non più a livello regionale ma nella zona Ovest della Lombardia nelle province di Varese, Como, Lecco, Monza, Milano, Lodi e Pavia negli allevamenti aderenti ai controlli funzionali e ha coinvolto oltre 582 allevamenti. L analisi, in questa seconda indagine, ha utilizzato la metodica analitica molecolare che permette di individuare la presenza di batteri mediante il riconoscimento a livello molecolare dei patogeni, questa metodica definita qpcr (Polymerase chain reaction) permette anche di indicare una valutazione sulla quantità di agente mastitogeno presente. Questa metodica è molto pratica in quanto il campione di latte non necessita di una stretta catena del freddo, può essere analizzato con presenza di conservante, congelato e, con una unica analisi, permette di individuare più patogeni. Rispetto alla prima indagine, grazie alla disponibilità di questa nuova tecnica, l attenzione si è rivolta non solo agli agenti mastitogeni contagiosi S. agalactiae, S. aureus, ma ha compreso la ricerca di Mycoplasma spp e di Prototheca spp. Si sottolinea che per gli ultimi due agenti si è trattata della prima indagine svolta nel territorio lombardo su un così alto numero di aziende. I dati delle indagini vengono riassunti nel grafico 1. Da sottolineare il grave peggioramento della situazione osservata nel 2017 rispetto al Infatti, S.aureus è passato dal 31 al 43% e S. agalactiae dall 1 al 10%. In pratica, gli allevamenti con infezioni da batteri contagiosi sono passati dal 32% del 2002 al 55% del 2017 (tenuto conto che anche i micoplasmi sono contagiosi), dato che è estremamente negativo per una regione come la Lombardia che ha produzioni quali-quantitative di latte di assoluta eccellenza a livello europeo. Quanto costano le infezioni da contagio Prendiamo in considerazione gli esiti riguardanti S. aureus. La situazione non è certamente rassicurante, già prima dell indagine epidemiologica (Piccinini et al. 2003) si erano stimate le perdite economiche a livello regionale a oltre 2 milioni di euro. Nel 2017 la stima di perdite per minor produzione su 251 allevamenti ammontano a 9 milioni di euro/anno che per singola azienda media (dove si è riscontrata positività a S. aureus) ammonta a euro/anno, con un mancato guadagno di 276 euro a capo adulto presente. Analizzando i dati produttivi negli allevamenti con presenza di S. agalactiae si rileva una minor produzione pari a 2,6 kg di latte/giorno/ capo. Questo per l azienda «media» lombarda significa una perdita di oltre euro/anno, oltre a riscontrare un contenuto di cellule somatiche del latte prodotto decisamente più alto, cellule/ml, contro un contenuto medio delle stalle sane di GRAFICO 1 - Prevalenza e tipologia di patogeni riscontrate nel 2002 con metodica tradizionale e nel 2017 con metodica qpcr % 2% 54% 33% 31% 12% 14% 10% 43% 10% S. agalactiae S. aureus S. canis Inquinati Negativi S. agalactiae S. aureus Prototheca Micoplasmi Negativi Da evidenziare il grave peggioramento dal 2002 al 2017: S. aureus è passato dal 31 al 43% e S. agalactiae dall 1 al 10%. Gli allevamenti con infezioni da batteri contagiosi sono passati dal 32 del 2002 al 55% del /2018 supplemento a L Informatore Agrario 13

3 INDICAZIONI PRATICHE L indicazione pratica è che questa metodica venga applicata per conoscere lo stato sanitario della mandria. Il protocollo proposto dal nostro gruppo di lavoro consiste nell effettuare tre prelievi del latte di massa nell arco di 7-10 giorni in flaconi con conservante, conservare in congelatore e consegnare al laboratorio Aral di Crema. Nel caso di grandi allevamenti con presenza di gruppi produttivi l indicazione è quella di effettuare il prelievo come descritto per gruppo produttivo, al fine di assicurarsi la massima sensibilità dell analisi. La stessa tecnica diagnostica può essere utilizzata nel caso di allevamenti che hanno una separazione in gruppi in base allo stato sanitario (mastiti). L indicazione è di effettuare analisi con scadenza regolare (settimanale) per verificare l assenza di infezioni nel gruppo «sano». In caso di positività, questo permette di affrontare immediatamente il problema individuando l animale infetto. cellule/ml. Quest ultimo dato conferma come la valutazione del dato cellulare offra altri interessanti spunti per confermare l impatto negativo delle infezioni mammarie sulla qualità del latte (grafico 2). I valori del contenuto medio cellulare si riferiscono al latte prodotto, rammentiamo ancora una volta che i dati dei controlli funzionali descrivono la produzione lattifera di tutto l allevamento, non il latte venduto che è al lordo dello scarto, a seconda del patogeno riscontrato nel latte di massa. I valori si riferiscono al solo riscontro presenza o assenza del patogeno nel latte di massa e non prendono in considerazione la prevalenza del patogeno riscontrato, a sottolineare che si sta osservando la problematica solo alla superficie galleggiante dell iceberg. L assoluta novità di questa recente indagine è però la ricerca di micoplasmi nel latte di massa, dato che, prima di questa indagine, non era noto per gli allevamenti della Lombardia. La ricerca di micoplasma spp, grazie alla metodica della qpcr, si esegue in tempi estremamente brevi e senza richiedere terreni specifici che sono costosi e relativamente poco affidabili. I dati hanno dimostrato che questa infezione si riscontra in allevamenti di grandi dimensioni con un notevole innalzamento della conta cellulare senza un apparente perdita di produzione. Non dobbiamo però farci illudere da quest ultimo dato perché è probabilmente dovuto proprio alle dimensioni degli allevamenti che «mascherano» le perdite. La relativa bassa frequenza di tali infezioni è positiva, ma rappresenta un campanello d allarme che stimola un approfondimento del problema nella realtà italiana. I valori medi di produzione, contenuto cellulare e dimensione dell allevamento a seconda del riscontro batteriologico, vengono riportati nella tabella 1. A vantaggio dell allevatore La lotta alla mastite si basa sulla prevenzione. Prevenzione vuol dire conoscere la capacità produttiva dei singoli capi, e il metodo più semplice è di affidarsi ai controlli funzionali che offrono all allevatore una notevolissima quantità di dati quanti-qualitativi registrati e a disposizione dell allevatore per analizzare e capire le dinamiche dell allevamento. Il parametro GRAFICO 2 - Effetto della presenza di un patogeno sul contenuto cellulare medio annuo Negativi Prototheca S. aureus Micoplasmi S. agalactiae Cellule somatiche (.000) Patogeni La ricerca di micoplasma grazie alla metodica qpcr si esegue in tempi brevi e a costi ridotti Un valore di cellule/ml è decisamente alto e superiore di rispetto alle stalle sane (con cellule/ml). Questo conferma come la valutazione del dato cellulare offra altri interessanti spunti per confermare l impatto negativo delle infezioni mammarie sulla qualità del latte. 14 supplemento a L Informatore Agrario 27-28/2018

4 gestionale strategico per conoscere la santità della mammella è il contenuto di cellule somatiche nel latte o la sua trasformazione logaritmica (o Linear score), infatti il contenuto in cellule somatiche è la risposta infiammatoria della vacca all attacco batterico in mammella. Solo questo ovviamente non basta, ma vero è che gli allevamenti aderenti ai controlli funzionali hanno una miglior qualità del latte. Questo ci indica anche che solo con la conoscenza delle problematiche aziendali e con la volontà di risolvere le criticità per mezzo dell applicazione di protocolli adeguati e l utilizzo di indagini analitiche più performanti, coadiuvati da consulenti motivati, il risultato economico finale è sicuramente a vantaggio dell allevatore e della sanità della mandria. Lucio Zanini Specialista qualità latte SATA-Aral Alfonso Zecconi Dipartimento di scienze veterinarie e sanità pubblica Università di Milano Il protocollo proposto per questa indagine è quello di effettuare tre prelievi del latte di massa nell arco di 7-10 giorni Per commenti all articolo, chiarimenti o suggerimenti scrivi a: redazione@informatoreagrario.it Questo articolo è corredato di bibliografia/contenuti extra. Gli Abbonati potranno scaricare il contenuto completo dalla Banca Dati Articoli in formato PDF su: /2018 supplemento a L Informatore Agrario 15

5 $ $ ARTICOLO PUBBLICATO SUL SUPPLEMENTO A L INFORMATORE AGRARIO N. 28/2018 A PAG. 12 qpcr, diagnosi di più patogeni nella stessa analisi BIBLIOGRAFIA Piccinini R, Binda E, Zanini L, Zecconi A La presenza di batteri contagiosi riduce la produzione di latte. Informatore Agrario. 59. Sangiorgi F, Zanini L, Zecconi A Sistemi di mungitura. Manuale pratico per la scelta, la progettazione, la gestione e la manutenzione. Verona: Edizioni L Informatore Agrario. Zecconi A, Di Pietro M, Fantini A, Sangiorgi F Mastite bovina. Manuale pratico per un efficace controllo in stalla. Verona: Edizioni L Informatore Agrario.

6 Edizioni L Informatore Agrario Tutti i diritti riservati, a norma della Legge sul Diritto d Autore e le sue successive modificazioni. Ogni utilizzo di quest opera per usi diversi da quello personale e privato è tassativamente vietato. Edizioni L Informatore Agrario S.r.l. non potrà comunque essere ritenuta responsabile per eventuali malfunzionamenti e/o danni di qualsiasi natura connessi all uso dell opera.