RETROVIRIDAE. Acido nucleico. Envelope + Polimerasi virale + Diametro del virione (nm) Dimensione del genoma (kb) 3,5-9

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1 RETROVIRIDAE RETROVIRIDAE Acido nucleico RNA Simmetria del capside Icosaedrica Envelope + Struttura del genoma ss (+) copie Classificazione di Baltimore VI Polimerasi virale + Diametro del virione (nm) Dimensione del genoma (kb) 3,5-9 MLV (Murine Leukemia Virus)

2 Three Retroviridae subfamilies: Subfamily Morph. groupexamples Oncoviruses Type A Intracisternal A Particles (noninfectious) Type B Mouse Mammary Tumor (MMTV) Type C Avian Sarcoma and Leukemia Murine Sarcoma and Leukemia Human T-cell leukemia virus (HTLV) Type D Mason Pfizer monkey (MPMV) Lentiviruses Spumaviruses Visna, HIV, SIV Human Foamy virus (cytopathic in vitro, no disease association) HIV

3 AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) 1980/81- Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi omosessuali: gay g yp pneumonia ) ) e definizione clinica della sindrome Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus ) ed inizialmente etichettato: LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLV- III ( perché erroneamente ritenuto correlato ai retrovirus oncogeni umani già noti: HTLV-I e HTLV-II). ) Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di anticorpi. I virus responsabili dell AIDS Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2 HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è responsabile della maggior parte dei casi di AIDS HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale, nei Caraibi e nell America meridionale ed è di gran lunga meno virulento Virus analoghi, responsabili di sindromi assai simili (immunodeficienza i acquisita), it sono stati ti dimostrati ti anche in varie specie animali : scimmie (SIV), felini (FIV), etc.

4 Caratteri generali di HIV-1 HIV-1 appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae della famiglia Retroviridae I lentivirus hanno i caratteri generali dei retrovirus con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo replicativo e l organizzazione generale del genoma che presenta, però, in aggiunta ai geni fondamentali gag, pol ed env, una serie di geni accessori e regolatori che svolgono un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus. HIV - The Virus Membrane: host derived Two glycoproteins: gp160 gp120 and gp41 gp41 is fusogen that spans the membrane sugars: immunosilent vaccine problem

5 HIV - The Virus Group-Specific Antigens p17: inner surface - myristoylated p24: nucleocapsid p9: nucleocapsid associated with RNA GAG gene HIV - The Virus Enzymes Polymerase (reverse transcriptase) Integrase Protease (cuts polyproteins) POL gene

6 HIV - The Virus HIV - Life History A retrovirus Latency Specific destruction of CD4+ cells How does the virus enter the cell?

7 HIV - Life History Entry into the cell T4 (CD4+) cells are major target Human HeLa Cell Human HeLa Cell transfected with CD4 antigen NOT INFECTED INFECTED But NOT the whole answer since this does not happen if CD4 is transfected into a MOUSE cell HIV - Life History Fusion at ambient ph No need for entry into lysosomes Syncytia Profound significance for AIDS progression Profound significance for therapy

8 HIV - Life History Why do CD4-transfected human cells become infected but CD4-transfected mouse cells do not? Human cells must possess a co-factor for infection that mouse cells do not Co-Receptors CD8+ Cells MIP-1 alpha MIP-1 beta RANTES Chemokines Block HIV infection of macrophages HIV - Life History HIV chemokine CD4 CCR5 CD4 CCR5 CD4 Mutant CCR5 macrophage

9 Le fasi del ciclo replicativo di HIV-1 comprendono: L attacco dell antirecettore (gp120) presente all esterno dell envelope, al recettore (CD4) ed ai co-recettori (CCR5, CXR4, etc) delle cellule sensibili, seguito dalla fusione dell envelope con la membrana cellulare e dalla penetrazione del nucleocapside virale nel citoplasma TROPISMO Il tropismo cellulare di HIV-1 In vivo: Stipiti con capacità di crescere in CTL (stipiti linfotropi) Stipiti con capacità di infettare i MP (stipiti MPtropi), In vitro entrambi crescono bene in colture primarie di linfociti da sangue periferico

10 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti iti virali macrofago (MP)-tropi sono predominanti tidurante la fase asintomatica dell infezione e si ritrovano costantemente durante il corso della malattia, il che suggerisce un loro ruolo essenziale nella persistenza dell infezione La maggior parte del virus presente nei tessuti extra-linfoidi ed extravascolari iè associata ai imp Il tropismo cellulare di HIV-1 Sebbene CD4 sia il recettore cellulare essenziale all ancoraggio di HIV-1, esso non è sufficiente a consentirne la penetrazione intracellulare Perchè si attivi il peptide fusogeno (gp41) e si inneschi la fusione dell envelope virale con la membrana cellulare, l antirecettore virale (gp120) ancorato al CD4 deve reagire con altre molecole di superficie (corecettori)

11 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti MP-tropi legano alla superficie dei MP il recettore CC-CKR5 (specifico per le chemochine hi RANTES, MIP 1α e MIP 1β) che è essenziale per l infettività degli stipiti MP-tropi Analoga funzione anche i recettori 2b (CKR2b) e CKR3 (specifico per la chemochina eotaxin ) che però hanno una espressione più ristretta: Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti di HIV-1 linfotropi utilizzano come co-recettore la molecola l di superficie i già nota come LESTR (leukocyte expressed-seven transmembrane- domain-receptor) o fusin ed oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)

12 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti di linfotropi, utilizzano come co-recettore la molecola di superficie già nota come LESTR (leukocyte expressed-seven transmembrane- domainreceptor) o fusin ed oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) Il tropismo cellulare di HIV-1 Tutti e due i principali co-recettori (CC CKR5 e CX CKR4) sono espressi alla superficie dei linfociti da sangue periferico in coltura primaria, il che spiega la loro sensibilità alla infezione sia con stipiti linfo-tropi sia con stipiti MP-tropi

13 Il tropismo cellulare di HIV-1 La necessità di recettori di tipo CC o CX CKR, disponibili alla superficie p, p p delle cellule CD4+, per funzionare da co-recettori che consentano la fusione dell envelope virale con la membrana cellulare, spiega perchè alcune chemochine (RANTES, MIP-1α, MIP-1β), legandosi ai rispettivi recettori ed impedendo l attacco di gp120, possano avere azione antivirale

14 Schema della interazione di HIV-1 con il recettore CD4 ed i diversi corecettori presenti alla superficie delle cellule sensibili Progenie virale Acquisizione del pericapside Rna (+) genoma Assemblaggio Trascrittasi inversa Endonucleasi/ integrasi TAR Trascrizione AAAA RRE Proteine strutturali Proteasi Poliproteine SpS Traduzione Traduzione Proteine regolatrici Tat Rev

15 CD4 T-lymphocyte with mature HIV virions in cytoplasmic vacuoles Photo by Gelderblom, from Haseltine and Wong-Staal, Scientific American 259:53 53, Replicazione La retrotrascrizione dell RNA del genoma virale in DNA (provirus) che viene poi circolarizzato ed integrato nel genoma cellulare, eventi favoriti da la replicazione della cellula infetta la attivazione della cellula infetta La trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico e dei vari m RNA per la sintesi delle poliproteine virus-specifiche La formazione delle varie proteine funzionali (proteasi), l assemblaggio e la gemmazione dei virioni neoformati

16 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR Caratteri generali di HIV-1 Organizzazione del genoma Oltre ai geni strutturali gag, pol ed env, HIV possiede almeno altri sei geni con funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di replicazione virale LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR gag g g ( group-ag ) g) codifica le proteine del nucleo-capside o core virale, e la proteina della matrice virale In HIV-1 24-kD (p24) che forma il capside virale due proteine RNA-binding (p9/7 e p7/6) la proteina (p17) della matrice virale ( ruolo nella gemmazione )

17 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR pol, codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o trascrittasi inversa e gli altri enzimi (ribonucleasi H, proteasi, integrasi) associati al virione LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR env codifica una poliproteina di 88 kd (p88) che viene glicosilata a gp160 La proteasi virale scinde il precursore gp160 nelle due glicoproteine dell envelope: gp120 e gp41 gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame al recettore gp41 è una proteina idrofobica che garantisce l ancoraggio di gp120 attraverso legami non covalenti, è coinvolta nella fusione dell envelope virale con la membrana cellulare

18 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR Geni accessori e regolatori di HIV-1 L espressione dei geni con funzioni accessorie o regolatrici comporta complesse operazioni di splicing dei relativi RNAmessaggeri LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR vif (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la produzione di virus extracellulare infettante (forse intervenendo nella elaborazione finale dei prodotti del gene env e nell assemblaggio del core virale) Virioni defettivi in vif sono scarsamente infettanti per i linfociti o i macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si trasmettono o ancora a efficacemente e da cellula a cellula

19 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR vpu (virion protein U) ) presente solo in HIV-1, codifica una proteina di kd che facilita il trasporto di gp120 verso la membrana cellulare. Sebbene non essenziale per la replicazione di HIV-1, vpu sembra avere un ruolo nel corretto assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR vpr (viral protein R) ) codifica una proteina di 14 kd che viene associata al virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare

20 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR nef (p27) (negative factor) associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture di cellule l patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef defettivi Associata alla membrana cellulare, causa downregulation di CD4, provocandone la endocitosi e la degradazione nei fagolisosomi Coinvolta nel trasporto di proteine e/o nel signaling di membrana LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR tat (trans-activator ti t of transcription) ti ) consiste di due distinti esoni che codificano una proteina di 14 kd La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale della trascrizione del provirus e agisce: LTR 5 aumentandone la attività Transattivando la trascrizione di numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc. anche in cellule non-infette (azione paracrina)

21 LTR gag pol vif tat vpu vpr rev env nef LTR rev (regulator of expression of virion proteins) ( due esoni), codificano per p19 che favorisce il trasferimento nucleo-citoplasmatico di RNA-m unspliced La proteina Rev si lega agli m RNA virali in corrispondenza della sequenza RRE (Rev-responsive element) sita all interno del gene env, proteggendoli dalle operazioni di splicing Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell RNA genomico e degli m RNA per le proteine strutturali, tt limitando it altresì, indirettamente, t (attraverso il blocco della produzione di RNA-m spliced) l espressione propria e quella delle altre proteine accessorie e regolatrici Variabilità genetica di HIV-1 La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di controllo presenti nella duplicazione i del DNA e compie errori che si traducono nella comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie) nei diversi individui infetti nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo La variabilità è particolarmente evidente a livello di alcune zone di env mentre altri geni (ad es. tat) sono molto più conservati

22 Genetic variability of HIV-1 Genotypes: M, N and O Within M genotype, subtypes (clades): A-K High replication rate and high mutation rate = sequence diversity Up to 20% diversity in env within clade Sequence diversity affects immunogenic portions of virus Geographic distribution of HIV-1 Subtypes (Clades) B B B B C, A, D, B, E + A, B + others C, E, B C, B B, C + others B

23 La patogenesi dell AIDS L infezione da HIV è ematogena (si trasmette per scambio di siringhe con tracce di sangue infetto, per via omo- ed etero-sessuale, per trasmissione perinatale, attraverso la trasfusione di sangue o emoderivati infetti, etc.)

24 Distribuzione dei casi di AIDS notificati in Italia, alla fine del 1 trimestre 1999, a seconda delle modalità di trasmissione dell infezione (numero stimato di soggetti infetti: > ) Tossicod. Omosess. Eterosess. Trasfus. Perinatal. Ignota

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26 Quasi tutti (> 95%) i soggetti infetti sviluppano la malattia conclamata (con esito letale) dopo un lungo (anni) periodo di latenza clinica Latenza clinica, però, non vuol dire latenza virale L infezione si accompagna pg ad una progressiva e sostenuta replicazione del virus (in particolare negli organi linfoidi) che, per tutto il periodo asintomatico, viene contrastata e contenuta dalla risposta immune dell organismo, e ad una progressiva diminuzione dei linfociti T-CD4+ (normalmente circa 1.000/μl) Con la riduzione dei linfociti T-CD4+ al di sotto di una soglia critica (in genere, < 500/μl) e con la conseguente compromissione della capacità di risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia la fase sintomatica (AIDS) Le manifestazioni cliniche fondamentali sono rappresentate dalla comparsa di infezioni opportunistiche, dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi, sarcomadi Kaposiepidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS dementia complex)

27 La patogenesi dell AIDS La progressione verso la malattia è in rapporto alla quantità di virus infettante alla capacità replicativa del virus ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high) alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti) La patogenesi dell AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta distruzione di elementi cellulari ad opera della infezione virale

28 Inexorable decline of CD4+ T4 cells Why do all of the T4 cells disappear? At early stages of infection only 1 in 10,000 cells is infected Late 1 in 40 Of great importance to therapeutic strategy Virus destroys the cell as a result of budding But few cells are infected: Early stage of infection 1:10,000 Late 1:40 1. PUNCTURED MEMBRANE Why do all T4 cells disappear?

29 Why do all T4 cells disappear? Infected CD4 cell Gp120 positive Cells Fuse But syncytia not common Most T4 cells are not HIV+ Could sweep up uninfected cells Killing of CD4 cells 2. Syncytium Formation Uninfected CD4 cell Gp120 negative Why do all T4 cells disappear? Cytotoxic T cell BUT: Most cells are not infected Killing of CD4 cells 3. Cytotoxic T cell-mediated lysis

30 Killing of CD4+ cells 4. Binding of free Gp120 to CD4 antigen makes uninfected T4 cell look like an infected cell Complement-mediated lysis Could account for the loss of uninfected T4 cells Why do all T4 cells disappear? 5. Apoptosis of T4 cells. Apoptosis of T4 cells is normal in clonal deletion to overcome autoimmunity Also occurs with CD8 cells

31 HIV CD8 cell (no CD4 antigen) gp120 chemokine Macrophage? CXCR4 G protein signal? Binding to CXCR4 results in expression of TNFalpha receptor II Binding to CXCR4 results in expression of TNF-alpha on the cell surface Apoptosis of T cells CD8 cell Macrophage CXCR4 Death CD8 T cell apoptotic bodies

32 Oltre alla diminuzione dei linfociti T CD4+, i soggetti infetti da HIV-1 presentano una serie di citopenie periferiche in rapporto ad una profonda compromissione delle capacità di sopravvivenza e di proliferazione dei progenitori ematopoietici (cellule CD34+) del midollo osseo e del sangue circolante Le cellule CD34+, tuttavia, non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e la loro compromissione è soprattutto la conseguenza dell aumento di TGF-β1 endogeno, causato dalla interazione con gp120, e della esposizione al TGFβ1 esogeno iperprodotto dai MP stimolati da Tat. Un meccanismo patogenetico analogo è alla base delle lesioni del SNC I neuroni infatti non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza dell azione tossica di proteine virus-specifiche (gp120) o di citochine o prodotti tossici elaborati dalle cellule accessorie (glia, astrociti) infette da HIV-1

33 Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella comparsa del sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri fattori (HHV-8?) I long-term non progressors < 5% di soggetti infetti da più di anni non presenta segni di malattia o di compromissione della risposta immune e possiede un numero normale (o comunque superiore a 500/μl) di linfociti T CD4+? i ità li ti d l i i f tt t ( d i f dfttii) -minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi) -elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici (CD8+) -iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori -produzione di fattori antivirali (?) da parte dei linfociti T CD8+ -altro?

34 La diagnosi di infezione da HIV L infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva Sieropositività= diagnosi di infezione "in atto" La diagnosi di infezione da HIV La ricerca di anticorpi nei confronti di HIV Saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay o ELISA) preparazioni di antigeni virali le cui caratteristiche consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di HIV-1

35 La diagnosi di infezione da HIV Un risultato positivo all ELISA va sottoposto ad esame "di conferma" Immunoblotting strisce con i diversi peptidi pp di HIV-1 e gp36 di HIV-2 La diagnosi di infezione da HIV L immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi g g p interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.

36 La diagnosi di infezione da HIV Limiti della sierologia 1) fase iniziale (3-4 settimane): la cosiddetta "finestra" iniziale 2) neonati di madri infette da HIV (anticorpi sierici materni) 3) in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline Diagnostica Virologica: ricerca del virus. La diagnosi di infezione da HIV Isolamento del virus in colture di cellule indicata: a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo (sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua resistenza ai farmaci antiretrovirali b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato territorio Determinazione dell antigenemia (p24 nel sangue) Determinazione dell RNAemia (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue)

37 Il follow-up virologico del paziente viral load il livello e l andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale per: a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali, b) giudicare l efficacia del regime terapeutico in atto, c) valutare l andamento dell infezione sotto il profilo prognostico Per valutare il viral load : 1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR) Indica l ampiezza del reservoir di virus presente nell organismo, non sempre correlata alla intensità della replicazione virale 2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico misurata in colture di cellule in vitro 3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT-PCR o metodi analoghi) Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus

38 Il follow-up virologico del paziente Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla presenza di infezione sintomatica e/o al numero di linfociti T CD4+) è utilizzato per decidere l inizio della terapia con farmaci antiretrovirali valutare l efficacia del regime terapeutico in atto, valutare la prognosi della malattia

39 Anti-HIV Strategies Highlyg y Active Anti- Retroviral Therapy HAART: Two nucleoside analog RT inhibitors and 1 protease inhibitor Now also: Two nucleoside analog RT inhibitors and 1 non nucleoside La resistenza di HIV-1 ai farmaci antiretrovirali Per replicare il genoma di HIV intervengono tre polimerasi: Trasciptasi inversa virale DNA pol RNA pol 3x10-5 errori per base incorporata Durante la prima fase dell infezione, la popolazione virale sembra essere monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è disomogenea. Se non fosse per i mutanti resistenti, l infezione potrebbe essere controllata.

40 HIV poses special problems for vaccine development Genetic variability of the virus Rapid replication, high mutation rate immune escape mutants Latency and persistence HIV-1 infects CD4 cells and broadly impairs immune responses Immune evasion by virus Ability of the immune system to prevent or control HIV-1 infection is uncertain

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