RETROVIRIDAE (Lentivirus)

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1 RETROVIRIDAE (Lentivirus)

2 CARATTERISTICHE GENERALI - Forma: sferica - Diametro: 100 nm - Genoma: 2 molecole uguali di RNA monocatenario lineare 6 peso 4 6 x 10 dalton - Presenza di involucro esterno derivato dalla membrana plasmatica - Nucleocapside con simmetria elicoidale - Assemblaggio: citoplasmatico - 3 geni sempre presenti ed essenziali: gag pol env L ordine genico è invariato in tutti i Retrovirus: 5 gag pol env 3 alcuni hanno geni addizionali.

3 Tre sottofamiglie: Sottofamiglia Morf. Oncoviruses Tipo A Tipo B Tipo C Tipo D Esempi Intracisternal A Particles (non-infectious) Mouse Mammary Tumor (MMTV) Avian Sarcoma and Leukemia Murine Sarcoma and Leukemia Human T-cell leukemia virus (HTLV) Mason Pf izer monkey (MPMV) Lentiviruses Visna, HIV, SIV Spumaviruses Human Foamy virus (citopatico in vitro, non associato a malattia)

4 HIV (human immunodeficiency virus)

5 AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) 1980/81 - Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi omosessuali: gay pneumonia ) e definizione clinica della sindrome Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus ) ed inizialmente etichettato: LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLV-III ( perché erroneamente ritenuto correlato ai retrovirus oncogeni umani già noti: HTLV-I e HTLV-II) Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di anticorpi. 5

6 I virus responsabili dell AIDS Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2 HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è responsabile della maggior parte dei casi di AIDS HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale, nei Caraibi e nell America meridionale ed è di gran lunga meno virulento Virus analoghi, responsabili di sindromi assai simili (immunodeficienza acquisita), sono stati dimostrati anche in varie specie animali : scimmie (SIV), felini (FIV), etc.

7 Caratteri generali di HIV-1 HIV-1 appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae della famiglia Retroviridae I lentivirus hanno i caratteri generali dei retrovirus con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo replicativo e l organizzazione generale del genoma che presenta, però, in aggiunta ai geni fondamentali gag, pol ed env, una serie di geni accessori e regolatori che svolgono un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus.

8 HIV: ANATOMIA DEL VIRIONE

9 HIV: ANATOMIA DEL VIRIONE From Gallo and Montagnier, Scientific American, 259:42, 1988.

10 Le fasi del ciclo replicativo di HIV-1 comprendono: L attacco dell'antirecettore (gp120) presente all esterno dell envelope, al recettore (CD4) ed ai co-recettori (CCR5, CXR4, etc) delle cellule sensibili, seguito dalla fusione dell envelope con la membrana cellulare e dalla penetrazione del nucleocapside virale nel citoplasma TROPISMO

11 Il tropismo cellulare di HIV-1 In vivo: Stipiti con capacità di crescere in CTL (stipiti linfotropi) Stipiti con capacità di infettare i MP (stipiti MPtropi), In vitro entrambi crescono bene in colture primarie di linfociti da sangue periferico

12 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti virali macrofago (MP)-tropi sono predominanti durante la fase asintomatica dell infezione e si ritrovano costantemente durante il corso della malattia, il che suggerisce un loro ruolo essenziale nella persistenza dell infezione La maggior parte del virus presente nei tessuti extra-linfoidi ed extravascolari è associata ai MP

13 Il tropismo cellulare di HIV-1 Sebbene CD4 sia il recettore cellulare essenziale all ancoraggio di HIV-1, esso non è sufficiente a consentirne la penetrazione intracellulare Perchè si attivi il peptide fusogeno (gp41) e si inneschi la fusione dell envelope virale con la membrana cellulare, l antirecettore virale (gp120) ancorato al CD4 deve reagire con altre molecole di superficie (corecettori)

14 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti MP-tropi legano alla superficie dei MP il recettore CC-CKR5 (specifico per le chemochine RANTES, MIP 1-alfa e MIP 1-beta) che è essenziale per l infettività degli stipiti MP-tropi Analoga funzione anche i recettori 2b (CKR2b) e CKR3 (specifico per la chemochina eotaxin ) che però hanno una espressione più ristretta

15 Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti di HIV-1 linfotropi utilizzano come co-recettore la molecola di superficie già nota come LESTR (leukocyte expressed-seven transmembrane- domain-receptor) o fusin ed oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)

16 Il tropismo cellulare di HIV-1 Tutti e due i principali co-recettori (CC CKR5 e CX CKR4) sono espressi alla superficie dei linfociti da sangue periferico in coltura primaria, il che spiega la loro sensibilità alla infezione sia con stipiti linfo-tropi sia con stipiti MP-tropi

17 Il tropismo cellulare di HIV-1 La necessità di recettori di tipo CC o CX CKR, disponibili alla superficie delle cellule CD4+, per funzionare da co-recettori che consentano la fusione dell envelope virale con la membrana cellulare, spiega perchè alcune chemochine (RANTES, MIP-alfa, MIP-1beta), legandosi ai rispettivi recettori ed impedendo l attacco di gp120, possano avere azione antivirale

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19 Schema della interazione di HIV-1 con il recettore CD4 ed i diversi corecettori presenti alla superficie delle cellule sensibili

20 Progenie virale Acquisizione del pericapside Rna (+) genoma Assemblaggio Trascrittasi inversa Endonucleasi/ integrasi Proteine strutturali Trascrizione AAAA TAR SpS Traduzione Proteine regolatrici Tat Rev RRE Proteasi Poliproteine Traduzione

21 Replicazione

22 Replicazione La retrotrascrizione dell RNA del genoma virale in DNA (provirus) che viene poi circolarizzato ed integrato nel genoma cellulare, eventi favoriti da la replicazione della cellula infetta la attivazione della cellula infetta La trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico e dei vari mrna per la sintesi delle poliproteine virus-specifiche La formazione delle varie proteine funzionali (proteasi), l assemblaggio e la gemmazione dei virioni neoformati

23 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Caratteri generali di HIV-1 Organizzazione del genoma Oltre ai geni strutturali gag, pol ed env, HIV possiede almeno altri sei geni con funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di replicazione virale

24 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env gag ( group-ag ) codifica le proteine del nucleo-capside o core virale, e la proteina della matrice virale In HIV-1 24-kD (p24) che forma il capside virale due proteine RNA-binding (p9/7 e p7/6) la proteina (p17) della matrice virale ( ruolo nella gemmazione )

25 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env pol, codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o trascrittasi inversa e gli altri enzimi (ribonucleasi H, proteasi, integrasi) associati al virione

26 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Trascrittasi inversa (p51/p66) Eterodimero Primer: trnalys specifico Sintesi DNA/RNA Prodotto finale: dsdna (provirale)

27 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Proteasi PR (p11) Omodimero Proteasi aspartica Asp-Thr-Ser_Gly Indispensabile

28 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Integrasi IN (p32) Omodimero Indispensabile

29 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env env codifica una poliproteina di 88 kd (p88) che viene glicosilata a gp160 La proteasi virale scinde il precursore gp160 nelle due glicoproteine dell envelope: gp120 e gp41 gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame al recettore gp41 è una proteina idrofobica che garantisce l ancoraggio di gp120 attraverso legami non covalenti, è coinvolta nella fusione dell envelope virale con la membrana cellulare

30 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Geni accessori e regolatori di HIV-1 L espressione dei geni con funzioni accessorie o regolatrici comporta complesse operazioni di splicing dei relativi RNAmessaggeri

31 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env vif (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la produzione di virus extracellulare infettante (forse intervenendo nella elaborazione finale dei prodotti del gene env e nell assemblaggio del core virale) Virioni defettivi in vif sono scarsamente infettanti per i linfociti o i macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si trasmettono ancora efficacemente da cellula a cellula

32 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env vpu (virion protein U) presente solo in HIV-1, codifica una proteina di kd che facilita il trasporto di gp120 verso la membrana cellulare. Sebbene non essenziale per la replicazione di HIV-1, vpu sembra avere un ruolo nel corretto assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati

33 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env vpr (viral protein R) codifica una proteina di 14 kd che viene associata al virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare

34 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env nef (p27) (negative factor) associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture di cellule patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef defettivi Associata alla membrana cellulare, causa downregulation di CD4, provocandone la endocitosi e la degradazione nei fagolisosomi Coinvolta nel trasporto di proteine e/o nel signaling di membrana

35 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env tat (trans-activator of transcription) consiste di due distinti esoni che codificano una proteina di 14 kd La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale della trascrizione del provirus e agisce: LTR 5 aumentandone la attività Transattivando la trascrizione di numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc. anche in cellule non-infette (azione paracrina)

36 LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env rev (regulator of expression of virion proteins) ( due esoni), codificano per p19 che favorisce il trasferimento nucleo-citoplasmatico di RNA-m unspliced La proteina Rev si lega agli m RNA virali in corrispondenza della sequenza RRE (Rev-responsive element) sita all interno del gene env, proteggendoli dalle operazioni di splicing Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell RNA genomico e degli m RNA per le proteine strutturali, limitando altresì, indirettamente, (attraverso il blocco della produzione di RNA-m spliced) l espressione propria e quella delle altre proteine accessorie e regolatrici

37 Variabilità genetica di HIV-1 La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di controllo presenti nella duplicazione del DNA e compie errori che si traducono nella comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie) nei diversi individui infetti nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo La variabilità è particolarmente evidente a livello di alcune zone di env mentre altri geni (ad es. tat) sono molto più conservati

38 Varibilità genetica di HIV-1 Genotipi: M (Main), N (New) e O (Outlier) Nell M, sottotipi (clades): A-K Elevato tasso di replicazionee di mutazione = variazione di esequenza Fino al 20% di varibilità in env all interno di un clade La diversità in sequenza porzioni immunogeniche variate del virus

39 Distribuzione geografica dei sottotipi di HIV-1 B B B B, C + others A, B + others C, B B C, E, B C, A, D, B, E + B

40 La patogenesi dell AIDS L infezione da HIV è ematogena (si trasmette per scambio di siringhe con tracce di sangue infetto, per via omo- ed eterosessuale, per trasmissione perinatale, attraverso la trasfusione di sangue o emoderivati infetti, etc.)

41 Distribuzione dei casi di AIDS notificati in Italia, alla fine del 1 trimestre 1999, a seconda delle modalità di trasmissione dell infezione (numero stimato di soggetti infetti: > ) Tossicod. Omosess. Eterosess. Trasfus. Perinatal. Ignota

42 Quasi tutti (> 95%) i soggetti infetti sviluppano la malattia conclamata (con esito letale) dopo un lungo (anni) periodo di latenza clinica Latenza clinica, però, non vuol dire latenza virale L infezione si accompagna ad una progressiva e sostenuta replicazione del virus (in particolare negli organi linfoidi) che, per tutto il periodo asintomatico, viene contrastata e contenuta dalla risposta immune dell organismo, e ad una progressiva diminuzione dei linfociti T-CD4+ (normalmente circa 1.000/ l)

43 Decorso tipico

44 Con la riduzione dei linfociti T-CD4+ al di sotto di una soglia critica (in genere, < 500/ l) e con la conseguente compromissione della capacità di risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia la fase sintomatica (AIDS) Le manifestazioni cliniche fondamentali sono rappresentate dalla comparsa di infezioni opportunistiche, dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi, sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS dementia complex)

45 La patogenesi dell AIDS La progressione verso la malattia è in rapporto alla quantità di virus infettante alla capacità replicativa del virus ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high) alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti) La patogenesi dell AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta distruzione di elementi cellulari ad opera della infezione virale

46 Oltre alla diminuzione dei linfociti T CD4+, i soggetti infetti da HIV-1 presentano una serie di citopenie periferiche in rapporto ad una profonda compromissione delle capacità di sopravvivenza e di proliferazione dei progenitori ematopoietici (cellule CD34+) del midollo osseo e del sangue circolante Le cellule CD34+, tuttavia, non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e la loro compromissione è soprattutto la conseguenza dell aumento di TGF 1 endogeno, causato dalla interazione con gp120, e della esposizione al TGF- 1 esogeno iperprodotto dai MP stimolati da Tat.

47 Un meccanismo patogenetico analogo è alla base delle lesioni del SNC I neuroni infatti non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza dell azione tossica di proteine virusspecifiche (gp120) o di citochine o prodotti tossici elaborati dalle cellule accessorie (glia, astrociti) infette da HIV-1

48 Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella comparsa del sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri fattori (HHV-8?)

49 I long-term non progressors < 5% di soggetti infetti da più di anni non presenta segni di malattia o di compromissione della risposta immune e possiede un numero normale (o comunque superiore a 500/ l) di linfociti T CD4+? -minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi) -elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici (CD8+) -iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori -produzione di fattori antivirali (?) da parte dei linfociti T CD8+ -altro?

50 La diagnosi di infezione da HIV L infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva Sieropositività = diagnosi di infezione "in atto"

51 La diagnosi di infezione da HIV La ricerca di anticorpi nei confronti di HIV Saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay o ELISA) preparazioni di antigeni virali le cui caratteristiche consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di HIV-1

52 La diagnosi di infezione da HIV Un risultato positivo all ELISA va sottoposto ad esame "di conferma" Immunoblotting strisce con i diversi peptidi di HIV-1 e gp36 di HIV-2

53 La diagnosi di infezione da HIV L immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.

54 La diagnosi di infezione da HIV Limiti della sierologia 1) fase iniziale (3-4 settimane): la cosiddetta "finestra" iniziale 2) neonati di madri infette da HIV (anticorpi sierici materni) 3) in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline Diagnostica Virologica: ricerca del virus.

55 La diagnosi di infezione da HIV Isolamento del virus in colture di cellule indicata: a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo (sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua resistenza ai farmaci antiretrovirali b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato territorio Determinazione dell antigenemia (p24 nel sangue) Determinazione dell RNAemia (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue)

56 Il follow-up virologico del paziente viral load il livello e l andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale per: a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali, b) giudicare l efficacia del regime terapeutico in atto, c) valutare l andamento dell infezione sotto il profilo prognostico

57 Per valutare il viral load : 1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR) Indica l ampiezza del reservoir di virus presente nell organismo, non sempre correlata alla intensità della replicazione virale 2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico misurata in colture di cellule in vitro 3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT-PCR o metodi analoghi) Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus

58 Il follow-up virologico del paziente Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla presenza di infezione sintomatica e/o al numero di linfociti T CD4+) è utilizzato per decidere l inizio della terapia con farmaci antiretrovirali valutare l efficacia del regime terapeutico in atto, valutare la prognosi della malattia

59 La resistenza di HIV-1 ai farmaci antiretrovirali Per replicare il genoma di HIV intervengono tre polimerasi: Trasciptasi inversa virale DNA pol RNA pol 3x10-5 errori per base incorporata Durante la prima fase dell infezione, la popolazione virale sembra essere monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è disomogenea. Se non fosse per i mutanti resistenti, l infezione potrebbe essere controllata.

60 Sviluppo del vaccino - Problematiche Varibilità genetica del virus Replicazione rapida elevato tasso di mutazione (mutanti che sfuggono al sistema immune Latenza e persistenza Infezione delle CD4 e compromissione immunitaria

61 The HIV Vaccine Pipeline, February 2003 Trials completed or in progress > 30 phase I trials ~12 phase II 2 phase III 1 phase III completed Multiple phase I trials with novel candidates planned for 2003