sicam-1 ELISA BE C Istruzioni per l Uso

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1 Istruzioni per l Uso sicam-1 ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di ICAM-1 umana solubile nei supernatanti di colture cellulari, siero, plasma, liquido amniotico e urina da minzione spontanea e bile. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 4 4. REAGENTI FORNITI 5 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 6 6. PRELIEVO DEI CAMPIONI 6 7. MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI 6 8. PRECAUZIONI PER L USO 7 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA PERFORMANCE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (26) 1/21

3 1. Uso Previsto Il sicam-1 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo della sicam-1 umana. Il sicam-1 umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. Sommario La Molecola-1 di Adesione Intracellulare (ICAM-1) fa parte della superfamiglia delle molecole di adesione di tipo immunoglobulinico ed è il ligando per l Antigene 1 associato alla funzione linfocitaria (LFA-1), un complesso alfa-beta che fa parte della famiglia dei recettori cellula-cellula e cellula-matrice delle integrine dei leucociti. Questa famiglia è costituita dalla glicoproteina di adesione dei leucociti LFA-1, che media l adesione linfocitaria, dalla proteina MAC-1 che media l adesione dei granulociti e dalla molecola p150,95. L ICAM-1 è una glicoproteina a singola catena con un core polipeptidico di 55 kd, che può essere espressa su cellule non-ematopoietiche di molti lineaggi, come cellule endoteliali vascolari, cellule epiteliali timiche, altre cellule epiteliali e fibroblasti e cellule ematopoietiche come macrofagi tissutali, T-linfoblasti stimolati con mitogeni, cellule B dei centri germinali e cellule dendritiche nelle tonsille, linfonodi e placche di Peyer. L ICAM-1 è inducibile nei fibroblasti e nelle cellule endoteliali tramite mediatori infiammatori come IL-1, TNF ed IFNγ entro poche ore ed è correlato all infiltrazione di linfociti nelle lesioni infiammatorie. L ICAM-1 sembra essere il marcatore iniziale di reazioni infiammatorie ed è espresso prima e in misura maggiore rispetto all HLA-DR. Il ruolo dell ICAM-1 quale marcatore di patologie è stato dimostrato in varie indicazioni e situazioni patologiche diverse. L up-regulation dell ICAM-1 nelle infiammazioni allergiche delle vie aeree è responsabile del reclutamento di leucociti attivati e della patogenesi della rinite allergica. Nella dermatite allergica da contatto l ICAM-1 sui cheratinociti è stato indotto già 4 ore dopo l applicazione del patch test allergico. Nel cancro della vescica esiste una correlazione diretta tra l espressione costitutiva dell ICAM-1 ed il grado istopatologico del tumore. I sieri dei pazienti malati di cancro GI con metastasi epatica presentano livelli di sicam-1 decisamente più elevati rispetto ai pazienti senza metastasi. L ICAM-1 è espresso sulle cellule maligne nel caso di patologie mieloidi e patologie linfoidi maligne di tipo B. Nella malattie linfoproliferative l ICAM-1 è correlate al grado di malignità. Nella mielopatia associata all HTLV-1 e nella leucemia delle cellule T degli adulti, I livelli di siero sicam-1 sono elevati. I pazienti con melanoma maligno hanno livelli di sicam-1 nel siero molto elevati, il che è rilevante a scopo diagnostico. Concentrazioni molto alte di sicam-1 sono state rilevate negli individui infettati da HIV-1. Nella malaria tropicale l ICAM-1 favorisce l adesione degli eritrociti infetti alle cellule endoteliali dei vasi capillari; quest evento è rilevante nella patogenesi della malaria cerebrale. Il sicam-1 è un buon parametro prognostico per valutare la responsività dell infezione da epatite B alla terapia IFNγ. L ICAM-1 sembra fornire il meccanismo fondamentale di rigetto dell allotrapianto corneale. L espressione dell ICAM-1 aumenta anche durante la fase di rigetto sulle cellule endoteliali dei vasi capillari, sulla membrana miocardica e l endocardio del cuore trapiantato. I livelli sicam-1 nel siero risultano significativamente aumentati con rigetto acuto di trapianto renale. La misurazione del sicam-1 è utile per distinguere il rigetto dall intossicazione del rene trapiantato da Ciclosporina-A. Un espressione forte dell ICAM-1 è visibile anche in pazienti con rigetto acuto, contrariamente a pazienti con trapianti di fegato stabili o pazienti senza complicazioni di rigetto. Si è rilevato che i livelli di ICAM-1 circolante nel siero and L-selectina erano elevati nel diabetes mellitus insulinodipendente (IDDM) e nei soggetti a rischio di IDDM (26) 2/21

4 Un aumento significativo di ICAM-1 nel siero è stato dimostrato nell uveite anteriore, nell uveite media e nei pazienti con sarcoidosi. Nelle prime ore di monitoraggio dell infarto miocardico acuto si misura un calo del sicam-1. Questo può attribuire al sicam-1 un significato dal punto di vista prognostico anche per l ischemia miocardica e la riperfusione. L incrementata espressione glomerulare dell ICAM-1 si vede in casi precoci di varie forme di glomerulonefrite e l espressione tubolare de novo dell ICAM-1 presenta una forte correlazione con l attività della patologia. Nell asma l ICAM-1 è up-regolato sull epitelio delle vie aeree infiammate e sull endotelio bronchiale, mediando in questo modo l adesione degli eosinofili. Il sicam-1 è molto elevato nel siero con fibrosi polmonare idiopatica o sarcoidosi. Il sicam-1 è un marker affidabile per i processi infiammatori nell ambito del sistema nervoso centrale che sono associati al sangue: Disordini della barriera CSF. L ICAM-1 solubile non è rilevabile nella maggior parte di campioni di fluido amniotico del secondo trimestre di gravidanza, ma quando è presente, è significativamente correlato ad un ritardo della crescita intrauterina e ad elevati livelli di alfa fetoproteina nel siero materno nel corso del secondo trimestre. Livelli elevati di sicam-1 sono correlati all attività dell artrite reumatoide. Nella psoriasi l ICAM-1 sui cheratinociti mostra una forte correlazione con la gravità della patologia e diminuisce sotto l effetto di una terapia mirata. Prima del trattamento i livelli di sicam-1 sono molto elevati se paragonati a controlli in buono stato di salute (26) 3/21

5 3. Principio del Test Un anticorpo di rivestimento sicam-1 anti-umana viene fatto assorbire dai micropozzetti. Figura 1 Micropozzetto rivestito Anticorpo di rivestimento Figura 2 La sicam-1 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene aggiunto l anticorpo sicam-1 anti-umana coniugato con l HRP, che si lega alla sicam-1 umana catturata dal primo anticorpo. Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato HRP Figura 3 Dopo l incubazione, la sicam-1 anti-umana coniugato all HRP e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Seconda Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di sicam-1 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 5 diluizioni standard di sicam-1 umana e si determina la concentrazione della sicam-1 umana. Figura 4 Substrato post-reazione (26) 4/21

6 4. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale sicam-1 umana 1 flaconcino (100 µl) di anticorpo HRP-Coniugato (anticorpo monoclonale sicam-1 umana) 2 flaconcini (500 µl) Standard sicam-1 umana, 100 ng/ml 1 flaconcino di Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino di Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino (12 ml) con Diluente dei Campioni 1 flaconcino (5 ml) con Tampone di Dosaggio Concentrato 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA) 1 bottiglia (50 ml) con Tampone di Lavaggio Concentrato 20x (PBS con 1 % Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 2 Copripiastra Adesivi (26) 5/21

7 5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C eccetto i controlli. Conservare i controlli liofilizatti a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C e i controlli a -20 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina), il liquido amniotico, urina da minzione spontanea e bile. Per questo dosaggio potrebbero essere idonei anche altri campioni biologici. Rimuovere il siero o il plasma dal coagulo o dalle celle prima possibile dopo la coagulazione e la separazione. Fare attenzione ad un possibile Effetto Gancio dovuto ad alte concentrazioni nei campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di sicam-1 umana bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelatodev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. Per misurare lo sicam-1 umana nell urina da minzione spontanea usare campioni non diluiti. I terreni di coltura cellulare senza componenti del siero non sono idonei alla determinazione dello sicam-1 umana con ELISA. 7. Material Necessari Ma No Forniti - Pipette graduate 5 ml e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 µl a 300 µl con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (opzionale: 620 nm lunghezza d onda di riferimento) - Acqua distillata o deionizatta - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (26) 6/21

8 8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (26) 7/21

9 9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tavola seguente: Numero di strisce Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua distillata (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperatura compresa fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tavola seguente: Numero di strisce Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua distillata (ml) Coniugato-HRP Il Coniugato-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. Il Coniugato-HRP deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tavola seguente: Numero di strisce Conuigato-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (26) 8/21

10 9.4. Standard sicam-1 Umana La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c) o oppure nei tubi (vedi 9.4.1) Diluizione Esterna degli Standard Etichettare 4 tubi, uno per ogni punto dello standard. S2, S3, S4, S5 Preparare diluizione seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 µl Diluente dei Campioni nei tubi S2-S5. Pipettare 225 ul di standard non diluito (serve come standard più alto S1, concentrazione dello standard 1 = 100 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S2, e mescolare (concentrazione dello standard 2 = 50.0 ng/ml). Ripetere le 3 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere Figura 5). Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 5 Transferire 225 µl S2 S3 S4 S5 Standard sicam-1 Umana non diluito (S1, 500 µl) Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl 9.5. Controlli Solubilizzare aggiungendo 100 µl di acqua distillata al controlli liofilizzati. Permettere al controlli di riposare per minuti. Agitare o mescolare delicatamente per assicurare una solubilizzazione completa ed omogenea. In seguito considerare i controlli allo stesso modo dei campioni del dosaggio. Per il range dei valori del controllo si rimanda al certificato di analysis o all'etichetta presente sulla fiala. Conservare i controlli ricostituiti in aliquote a -20 C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento (26) 9/21

11 10. Procedura del Test a. Stabilire il numero di strisce dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e i campioni di controllo opzionali devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al Soluzione Tampone di Lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello Standard in micropozetti (Alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.4.1) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a pozzetti standard B1/2-E1/2, lasciando A1/A2 vuoti. Pipettare 200 µl standard non diluito (vedi preparazione dello standard 4.4.1, concentrazione dello standard 1, S1 = 100 ng/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Trasferire 100 µl ai pozzetti B1 e B2 (concentrazione dello standard 2, S2 = 50 ng/ml). Mescolare il contenuto dei pozzetti B1 e B2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni e trasferire 100 µl, rispettivamente, nei pozzetti C1 e C2 (vedere Figura 6). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 2 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 6.3 ng/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (E1 e E2). Figura 6 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 S5 Standard sicam-1 Umana non diluito (= S1, 200 µl) Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl (26) 10/21

12 In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.4.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1-S5) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E Standard 1 (100.0 ng/ml) Standard 2 (50.0 ng/ml) Standard 3 (25.0 ng/ml) Standard 4 (12.5 ng/ml) Standard 5 (6.3 ng/ml) Standard 1 (100.0 ng/ml) Standard 2 (50.0 ng/ml) Standard 3 (25.0 ng/ml) Standard 4 (12.5 ng/ml) Standard 5 (6.3 ng/ml) Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 F Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 G Campione 1 Campione 1 Campione 9 Campione 9 H Campione 2 Campione 2 Campione 10 Campione 10 d. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 90 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 10 µl di campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare la Coniugato-HRP (consultare la sezione Coniugato-HRP 9.3 sulla Preparazione dei Reagenti). h. Dispensare 50 µl di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto. i. Coprire con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, un vortex a 400 rpm. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei pozzetti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB in tutti i pozzetti, inclusi quelli del bianco. l Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore delle D.O. di (26) 11/21

13 m. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Bloccante in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. n. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard di sicam-1 umana. Annotazione: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi. 11. Calcolo dei Risultati - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di sicam-1 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di sicam-1 umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di sicam-1 umana. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:10 (10 µl di campione + 90 µl di Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 10). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di sicam-1 umana (Efetto Gancio). Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna, secondo i valori stimati della sicam-1 umana, con un Diluente per Campioni, in modo da quantificare con precisione i livelli reali di sicam-1 umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di sicam-1 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (26) 12/21

14 Figura 7 Curva standard rappresentativa per il sicam-1 umana ELISA. La sicam-1 umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 10 sicam-1 ELISA OD (450 nm) ng/ml Tavola 2 Dati tipi del sicam-1 umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Conzentrazione sicam-1 Umana (ng/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi (26) 13/21

15 12. Limiti della Procedura - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la soluzione di lavaggiofresca, riempire con il tampone di lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione. 13. Performance Sensibilità Il limite di rilevamento della sicam-1 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 2.2 ng/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Recupero Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 2 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sicam-1 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sicam-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.1 % (26) 14/21

16 Tavola 3 La concentrazione media di sicam-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione. Campione Esperimento Concentrazione Media sicam-1 umana (ng/ml) CV (%) Inter-Dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 2 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sicam-1 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sicam-1 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 7.7 %. Tavola 4 La concentrazione media di sicam-1 umana ed il coefficiente di variazione di ogni campione Campione Concentrazione Media sicam-1 umana (ng/ml) CV (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 4 livelli di sicam-1 umana al Diluente dei Campioni (matrice del siero). I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. Il recupero rientrava in un range dal 82 % al 109 % con un recupero medio complessivo dell 99 % (26) 15/21

17 13.4. Parallelismo di Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di sicam-1 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 80 % al 102 % con un recupero medio complessivo del 93 % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione Diluzione 1 1:10 1:20 1:40 1:80 2 1:10 1:20 1:40 1:80 3 1:10 1:20 1:40 1:80 4 1:10 1:20 1:40 1:80 Concentrazione attesa di sicam-1 Umana (ng/ml) Concentrazione misurata di sicam-1 Umana (ng/ml) Recupero di concentrazione attesa di sicam-1 Umana (%) Stabilità dei Campioni Stabilità di Congelamento - Sgelo Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di sicam-1 umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della sicam-1 umana Stabilità di Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di sicam-1 umana ne è stato determinato dopo 24, 48 e 96 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della sicam-1 umana Comparazione di Siero e Plasma Di tre individui sono stati valutati il siero e l EDTA, il citrato ed il plasma eparinato ottenuti nello stesso momento temporale. I livelli di sicam-1 umana non erano molto diversi e quindi tutte queste preparazioni del sangue sono idonee alle determinazioni dello sicam-1 umana Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero sicam-1 umana positivo. Non si è constatata alcuna reattività crociata con stnf-r (60 kda), stnf-r (80 kda), IL-8/NAP-1, TNFα, TNFβ, IFNγ, IFNα2C, IFNω, IL-6, IL-2R, ELAM-1 e L-selectina (26) 16/21

18 13.8. Valori Attesi Per lo sicam-1 umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero, EDTA, citrato e plasma eparinato di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). Per i livelli di sicam-1 umana misurati vedi la Tavola 6. Tavola 6 Matrice di Campione Numero di Campioni Valutati Intervallo (ng/ml) Media (ng/ml) Deviazione Standard (ng/ml) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Eparina) Informazioni per gli Ordini Per gli ordini, si prega di contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche si prega di contattare: IBL@IBL-International.com (26) 17/21

19 15. Sommario di Preparazione dei Reagenti Tampone di Lavaggio (1x) Agguingere 50 ml del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Tampone di Lavaggio Concentrato (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Agguingere 5 ml di Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) a 95 ml de acqua distillata. Numero di strisce Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato-HRP Acqua Distillata (ml) Fare una diluzione 1:100 di Coniugato-HRP nel Tampone di Dosaggio Concentrato (1x): Numero di strisce Coniugato-HRP (ml) Controlli Agguingere 100 µl di acqua distillata al controlli liofilizzati. Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (26) 18/21

20 16. Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesti. 2. Lavare due volte le strisce micropozzetti con Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione dello standard in micropozetti: Agguingere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati a tutti pozetti standard lasciando gli primi pozzetti vuoti. Pipettare 200 µl standard non diluito nei primi pozzetti e creare diluzioni standard da transferire 100 µl da pozzetto per pozzetto. Buttare 100 µl degli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione standard esterna in tubi (vedi 9.4.1): Pipettare 100 µl di questi diluizioni standard nei strisce degli micropozzettil. 4. Agguingere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati, nei pozzetti bianchi. 5. Agguingere 90 µl di Diluente dei Campioni nei pozzetti di campioni. 6. Agguingere 10 µl dei campioni in duplicati nei pozzetti di campioni. 7. Preparare il Coniugato-HRP. 8. Agguingere 50 µl di Coniugato-HRP a tutti gli pozzetti. 9. Coprire i pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Svuotare e lavare gli pozzetti 3 volte con Tampone di Lavaggio. 11. Agguingere 100 µl della Soluzione Substrato TMB a tutti gli pozzetti. 12. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minutos. 13. Agguingere 100 µl della Soluzione Bloccante a tutti gli pozzetti. 14. Azzerare il spettofotomettro e leggere l assorbanza a 450 nm. Annotazione: Se le istruzioni in questo protocollo sono stati seguiti, i campioni sono stati diluiti 1:10 (10 µl di campione, 90 µl di Diluente dei Campioni), la concentrazione dalla curva standard risultante deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 10) (26) 19/21

21 17. Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 1. Rothlein, R.; Mainolfi, E. A.; Czajkowski, M.; Marlin, S. D.. A form of circulating ICAM-1 in human serum. J.Immunol. 1991; 147: Altomonte, M.; Colizzi, F.; Esposito, G.; Maio, M.. Circulating intercellular adhesion molecule 1 as a marker of disease progression in cutaneous melanoma. N Engl.J.Med. 1992; 327: Salafia, C. M.; DeVore, G. R.; Mainolfi, E.; Kelly, J.; Pezzullo, J. C.; Rothlein, R.. Circulating intercellular adhesion molecule-1 in amniotic fluid, maternal serum alpha-fetoprotein levels, and intrauterine growth retardation. Am.J.Obstet.Gynecol. 1993; Pober, J. S.; Gimbrone, M. A., Jr.; Lapierre, L. A.; Mendrick, D. L.; Fiers, W.; Rothlein, R.; Springer, T. A.. Overlapping patterns of activation of human endothelial cells by interleukin 1, tumor necrosis factor, and immune interferon. J.Immunol. 1986; 137: Dustin, M. L.; Rothlein, R.; Bhan, A. K.; Dinarello, C. A.; Springer, T. A.. Induction by IL 1 and interferongamma: tissue distribution, biochemistry, and function of a natural adherence molecule (ICAM-1). J.Immunol. 1986; 137: Lampeter, E. R.; Kishimoto, T. K.; Rothlein, R.; Mainolfi, E. A.; Bertrams, J.; Kolb, H.; Martin, S.. Elevated levels of circulating adhesion molecules in IDDM patients and in subjects at risk for IDDM. Diabetes 1992; 41: Vejlsgaard, G. L.; Ralfkiaer, E.; Avnstorp, C.; Czajkowski, M.; Marlin, S. D.; Rothlein, R.. Kinetics and characterization of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression on keratinocytes in various inflammatory skin lesions and malignant cutaneous lymphomas. J.Am.Acad.Dermatol. 1989; 20: Lal, R. B.; Mainolfi, E.; Rothlein, R.. Elevated levels of cicam-1 in patients with human T-cell leukemia virus type I associated myelopathy and adult T-cell leukemia. Blood 1992; 80: Salafia, C. M.; DeVore, G. R.; Mainolfi, E.; Kelly, J.; Pezzullo, J. C.; Rothlein, R.. Circulating intercellular adhesion molecule-1 in amniotic fluid, maternal serum alpha-fetoprotein levels, and intrauterine growth retardation. Am.J.Obstet.Gynecol. 1993; 169: Most, J.; Zangerle, R.; Herold, M.; Fuchs, D.; Wachter, H.; Fritsch, P.; Dierich, M. P.. Elevated concentrations of circulating intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in HIV-1 infection. J.Acquir.Immune Defic.Syndr. 1993; 6: Lisby, S.; Ralfkiaer, E.; Rothlein, R.; Vejlsgaard, G. L.. Intercellular adhesion molecule-i (ICAM-I) expression correlated to inflammation. Br.J.Dermatol. 1989; 120: Rothlein, R.; Dustin, M. L.; Marlin, S. D.; Springer, T. A.. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1. J. Immunol. 1986; 137: Harning, R.; Mainolfi, E.; Bystryn, J. C.; Henn, M.; Merluzzi, V. J.; Rothlein, R.. Serum levels of circulating intercellular adhesion molecule 1 in human malignant melanoma. Cancer Res. 1991; 51: Adams, D. H.; Hubscher, S. G.; Shaw, J.; Rothlein, R.; Neuberger, J. M.. Intercellular adhesion molecule 1 on liver allografts during rejection. Lancet 1989; 2: Potocnik, A. J.; Kinne, R.; Menninger, H.; Zacher, J.; Emmrich, F.; Kroczek, R. A.. Expression of activation antigens on T cells in rheumatoid arthritis patients. Scand.J.Immunol. 1990; 31: Becker, J. C.; Dummer, R.; Schwinn, A.; Hartmann, A. A.; Burg, G.. Circulating intercellular adhesion molecule-1 in melanoma patients: induction by interleukin-2 therapy. J.Immunother.(1991.) 1992; 12: Marlin, S. D.; Springer, T. A.. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1). Cell 1987; 51: Adams, D. H.; Mainolfi, E.; Elias, E.; Neuberger, J. M.; Rothlein, R.. Detection of circulating intercellular adhesion molecule-1 after liver transplantation-evidence of local release within the liver during graft rejection. Transplantation 1993; 55: Rothlein, R.; Czajkowski, M.; O'Neill, M. M.; Marlin, S. D.; Mainolfi, E.; Merluzzi, V. J.. Induction of intercellular adhesion molecule 1 on primary and continuous cell lines by pro-inflammatory cytokines. Regulation by pharmacologic agents and neutralizing antibodies. J.Immunol. 1988; 141: Wegner, C. D.; Gundel, R. H.; Reilly, P.; Haynes, N.; Letts, L. G.; Rothlein, R.. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the pathogenesis of asthma. Science 1990; 247: (26) 20/21

22 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /