Interleukin-2 ELISA BE C. Istruzioni per l Uso

Transcript

1 Istruzioni per l Uso Interleukin-2 ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Interleuchina-2 (IL-2) nei supernatanti di colture cellulari, siero e plasma umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (22) 1/18

3 1. USO PREVISTO L IL-2 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo della IL-2 umana. L IL-2 umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. SOMMARIO L Interleuchina-2 (IL-2) gioca un ruolo fondamentale nell attivazione e nella proliferazione dei linfociti in seguito al priming degli antigeni. L IL-2 ha un ruolo fondamentale nell espansione della maggior parte delle cellule T, delle cellule natural killer e delle B-cellule durante alcune fasi del loro responso. L IL-2 è una glicoproteina 15 kda codificata da un singolo gene collocato nella regione q26-28 del cromosoma 4 umano. Il polipeptide dedotto dal cdna consiste di 153 amminoacidi. L espressione del gene IL-2 a livello dell attivazione trascrizionale è regolata da vari percorsi. Per l IL-2 indotto in modo autocrino sulla superficie delle T-cellule, la proliferazione antigene-specifica di T-linfociti helper e citotossici in seguito a stimolazione è fortemente dipendente dall espressione dell IL-2, dalla sua secrezione e dal suo legame con i recettori. A parte il suo ruolo principale di mediare la proliferazione dei linfociti T antigene-specifici, l IL-2 modula l espressione dell interferone e dei principali antigeni dell istocompatibilità, stimola la proliferazione e la differenziazione di cellule B attivate, aumenta l attività delle cellule natural killer ed inibisce la formazione di colonie di granulociti-macrofagi. In condizioni fisiologiche e patologiche si sono osservate alterazioni nella capacità delle cellule T di sintetizzare l IL-2. A causa del ruolo essenziale dell IL-2 nella risposta immune, l IL-2 si è dimostrato una molecola molto importante per le sue implicazioni diagnostiche e terapeutiche. L IL-2 viene usato nella terapia contro il cancro, in quando dimostra di avere effetti anti-tumorali. Il monitoraggio dell IL-2 nel siero fornisce una visione più dettagliata in molte situazioni patologiche come cancro, patologie infettive, rigetto di trapianti, sclerosi multipla, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico e diabete di tipo I (22) 2/18

4 3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-il-2 umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito L IL-2 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-il-2 umana coniugato di biotina, che si lega con l IL-2 umana catturata dal primo anticorpo. Anticorpo Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione degli anticorpi di anti-il-2 umana coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo anti-il-2 umana coniugato alla biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 4 Streptavidina-HRP - Terza Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di IL-2 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-2 umana e si determina la concentrazione del campione di IL-2 umana. Figura 5 Substrato post-reazione (22) 3/18

5 4. REAGENTI FORNITI 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti-il-2 umana 1 flaconcino (70 µl) con Coniugato di Biotina (anticorpi policlonali anti-il-2 umana) 1 flaconcino (150 µl) con Streptavidina-HRP 2 flaconcini con Standard IL-2 umana liofilizzato, 2.4 ng/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino (5 ml) con Tampone di Dosaggio concentrato 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA) 1 flaconcino Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino (12 ml) Diluente dei Campioni 1 flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 4 Copripiastra adesivi 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE Conservare i reagenti del kit a 2-8 C ecetto gli controlli. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C, gli controlli a -20 C rispettativamente. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina). Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. Prestare attenzione a un possibile "Effeto Gancio" a causa di alti concentrazioni di campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-2 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela (22) 4/18

6 7. MATERIALI NECESSAIR MA NO FORNITI Pipette graduate da 5 ml e 1000 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. PRECAUZIONI PER L USO - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (22) 5/18

7 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio secondo la tabella seguente; Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrado (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperatura compresa fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di strisce Tampone di Dosaggio (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato di Biotina Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (22) 6/18

8 9.5. Standard IL-2 Umana Ricostituire lo Standard IL-2 umana aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 2.4 ng/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.e.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1) Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Diluente dei Campioni a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 2.4 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 1.2 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 6 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-2 umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl 9.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 800 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento (22) 7/18

9 10. PROCEDURA DEL TEST a. Per la misurazione in duplicato è necessario un campione da 2 x 50 μl. I campioni di siero o plasma, come i controlli ricostituiti, si applicano non diluiti. I livelli di IL-2 umana nei supernatanti delle colture cellulari possono variare considerevolmente. Per ogni singolo campione si deve determinare la diluizione ottimale. Per campioni di colture cellulari sconosciuti è utile analizzare campioni sia non diluiti, sia pre-diluiti (ad es.: 1:20-1:50) in parallelo, coprendo in questo modo, con un dosaggio, un range più ampio. Per essere misurati correttamente, supernatanti delle colture cellulari con concentrazioni molto alte di IL-2 umana richiedono diluizioni alte (ad es. fino ad 1:2000). Questi campioni devono essere pre-diluiti nel rispettivo mezzo di coltura cellulare. La diluizione finale dev essere eseguita nel Diluente dei Campioni secondo lo schema seguente: Diluizione Volumen di Campione Diluente dei Campioni Fattore di Diluizione: 1 : 5 50 µl Campione 200 µl Diluente dei Campioni 5 1:10 25 µl Campione 225 µl Diluente dei Campioni 10 1:50 10 µl Campione 490 µl Diluente dei Campioni 50 1:100 1:1000 1:2000 A: 10 µl Campione B:25 µl prediluizione A A: 10 µl Campione B:25 µl prediluizione A A: 10 µl Campione B:10 µl prediluizione A 90 µl Diluente dei Campioni 225 µl Diluente dei Campioni 990 µl Medio di Colture 225 µl Diluente dei Campioni 390 µl Medio di Colture 490 µl Diluente dei Campioni b. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. c. Preparare il Coniugato di Biotina (consultare la sezione Coniugato Biotina 9.3 sulla preparazione dei reagenti). d. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. e. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 2400 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 18.8 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2) (22) 8/18

10 Figura 7 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-2 umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A Standard 1 ( pg/ml) Standard 1 ( pg/ml) Campione 1 Campione 1 B Standard 2 (600.0 pg/ml) Standard 2 (600.0 pg/ml) Campione 2 Campione 2 C Standard 3 (300.0 pg/ml) Standard 3 (300.0 pg/ml) Campione 3 Campione 3 D Standard 4 (150.0 pg/ml) Standard 4 (150.0 pg/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (75.0 pg/ml) Standard 5 (75.0 pg/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (37.5 pg/ml) Standard 6 (37.5 pg/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (18.8 pg/ml) Standard 7 (18.8 pg/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (22) 9/18

11 f. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. g. Dispensare 50 µl di Diluente dei Campioni ai pozzetti dei campioni. h. Dispensare 50 µl di ogni muestra in duplicato ai pozzetti dei campioni. i. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. j. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. k. Preparare la Streptavidina-HRP (vedere la Preparazione di Streptavidina-HRP 9.4). l. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto d. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. m. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco. n. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. o. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto d. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. p. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. q. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 30 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di r. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. s. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso d incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi (22) 10/18

12 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-2 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IL-2 umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-2 umana. - Siero, plasma e campioni di controllo sono stati diluito 1:2 (50 µl + campione 50 µl diluente del campione (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2). - Se sono stati misurati surnatanti di colture cellulari la concentrazione leggere dalla curva standard deve essere moltiplicato per il fattore di prediluizione individuale (y) e il fattore di diluizione (2) del test (x 2A). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-2 umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell IL-2 umana, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-2 umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-2 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per l IL-2 umana ELISA. L IL-2 umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio Interleukin-2 ELISA DO (450 nm) (pg/ml) (22) 11/18

13 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell IL-2 umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione IL-2 Umana (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) % % % % % % % Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (22) 12/18

14 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Sensibilità Il limite di rilevamento dell IL-2 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 9.1 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 4 campioni di siero e 4 campioni di supernatanti di colture cellulari contenenti diverse concentrazioni di IL-2 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.0 %. Tavola 3 La concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione media di IL-2 umana (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) 3.3 % 3.7 % 3.9 % 5.0 % 6.8 % 3.1 % 7.6 % 7.6 % 5.5 % 6.1 % 4.0 % 10.0 % 4.0 % 9.5 % % 7.4 % 8.8 % 14.8 % 5.5 % 6.6 % (22) 13/18

15 Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di supernatanti di colture cellulari contenenti diverse concentrazioni di IL-2 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 5.0 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di Variazione IL-2 Umana (pg/ml) (%) % % % % % % % Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 3 livelli di IL-2 umana in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 2 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. In questi esperimenti il siero non addizionati sono stati usati come bianco. Tavola 5 Matrice del Addizione alto Addizione media Addizione bassa Campione Media (%) Intervalo (%) Media (%) Intervalo (%) Media (%) Intervalo (%) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato Plasma (Eparina) Supernatante di colture celular (22) 14/18

16 13.4. Parallelismo della Diluizione Campioni di siero, di plasma (EDTA, citrato ed eparina) e di supernatanti di coltura celular con diversi livelli di IL-2 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Vedere Tavola 6 per i dati. Tavola 6 Matrice del Campione Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato Plasma (Eparina) Supernatanti di coltura celular Recupero di Val. Att. Diluzione Media (%) Intervalo (%) 1: : : :4 1:8 1:16 1:4 1:8 1:16 1:4 1:8 1:16 1:4 1:8 1: Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero e supernatanti di colture cellulari (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-2 umana. Con il congelamento e lo scongelamento fino a 3 cicli non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-2 umana.si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-2 umana (20 %) con altri congelamento e lo scongelamento Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero e di supernatanti di colture cellulari (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-2 umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello IL-2 umana. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-2 umana (20 %) durante la conservazione a 37 C dopo 24 ore Specificità La reattività crociata e l interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di IL-2 umana. Non si è rilevata alcuna reattività crociata o interferenza Valori Attesi In donatori sani non si sono trovati livelli rilevabili di IL-2 umana. Livelli elevati di IL-2 umana dipendono dal tipo di malattia immunologica (22) 15/18

17 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina Sommario: Preparazione dei Reagenti Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Coniugato di Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Buffer de Ensayo (1x): Numero di strisce Coniugato de Biotina (ml) Estreptavidina-HRP Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nel Buffer de Ensayo (1x): Numero di strisce Buffer de Ensayo (1x) (ml) Streptavidina-HRP (ml) Buffer de Ensayo (1x) (ml) Standard IL-2 Umana Reconstituire il Standard liofilizzato di IL-2 umana con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Controlli Aggiungere 800 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (22) 16/18

18 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 1. Prediluire gli supernatanti di coltura celulari con Diluente dei Campioni. 2. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 3. Preparare il Coniugato di Biotina. 4. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 5. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 6. Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco. 7. Aggiungere 50 μl di Diluente dei Campioni ai pozzetti di campione. 8. Aggiungere 50 μl di campione in duplicato ai pozzetti di campione. 9. Aggiungere 50 μl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 10. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 11. Preparare la Streptavidina-HRP. 12. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 13. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 14. Coprire le strisce e incubare 1 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 15. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 16. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 17. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 18. Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante TMB a tutti i pozzetti. 19. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota: I campioni di siero, plasma e di controllo sono state diluito 1:2 (50 µl + campione 50 µl diluente del campione (1x),.la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2). Se sono stati misurati surnatanti di colture cellulari la concentrazione leggere dalla curva standard deve essere moltiplicato per il fattore di prediluizione individuale (y) e il fattore di diluizione (2) del test (x 2y) (22) 17/18

19 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Naldini, A.; Fleischmann, W. R., Jr.; Ballas, Z. K.; Klimpel, K. D.; Klimpel, G. R.. Interleukin 2 inhibits in vitro granulocyte-macrophage colony formation. J.Immunol. 1987; 139: Tigges, M. A.; Casey, L. S.; Koshland, M. E.. Mechanism of interleukin-2 signaling: mediation of different outcomes by a single receptor and transduction pathway. Science 1989; 243: Gressler, V. H.; Weinkauff, R. E.; Franklin, W. A.; Golomb, H. M.. Modulation of the expression of major histocompatibility antigens on splenic hairy cells--differential effect upon in vitro treatment with alpha-2binterferon, gamma-interferon, and interleukin-2. Blood 1988; 72: Phadke, K.; Carlson, D. G.; Gitter, B. D.; Butler, L. D.. Role of interleukin 1 and interleukin 2 in rat and mouse arthritis models. J.Immunol. 1986; 136: Cornaby, A.; Simpson, M.; Vann, Rice R.; Dempsey, R.; Madras, P.; Jenkins, R.; Monaco, A.. Interleukin 2 levels and urine cytology distinguish between cyclosporine toxicity and rejection in renal and liver allograft recipients. Transplant Proc. 1988; 20: (22) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /