25/11/14. Variazioni morfologiche di dimensioni. Anomalie degli eritrociti. Variazioni morfologiche di colore. Variazioni morfologiche di forma

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1 Le cellule del sangue sono prodotte nel midollo osseo e negli organi linfatici secondari (milza e linfonodi) Il midollo osseo nell adulto occupa uno spazio di circa 4 litri; la meta è composto da midollo emopoietico, il resto da tessuto adiposo Nei bambini il midollo occupa uno spazio di circa 1,6 litri, ma è attivo al 100% ERITROCITI (RBC) - Globuli rossi Gli eritrociti della maggior parte dei mammiferi: -Sono privi di nucleo -Si presentano come cellule di forma discoidale appiattita con un incavo centrale -diametro medio di 8 micron (8 millesimi di millimetro) -trasportano ossigeno e anidride carbonica Anomalie degli eritrociti La morfologia dei globuli rossi può subire modificazioni sotto l influsso di numerose condizioni: modificazioni di forma modificazioni di colore variazioni di dimensione presenza di corpi inclusi variazioni del normale comportamento cellulare Variazioni morfologiche di dimensioni Anisocitosi: variazione del diametro degli eritrociti in individui normali nella stessa specie. Patologicamente: di frequente riscontro nelle anemie. microciti macrociti Variazioni morfologiche di colore Ipocromia: - i GR appaiono di colore più chiaro del consueto (colorazione di Wright) - rispecchia un calo della quantità di emoglobina presente nelle singole cellule (si associa ad anemia per carenza di Fe) Variazioni morfologiche di forma poichilocitosi: forma anomala (es., anemia) acantocitosi: spiculi acuminati sulla superficie (es., malattia epatica) Ipercromia: i GR appaiono di colore più scuro del consueto (colorazione di Wright): non può trattarsi di un eccesso di emoglobina poiché ogni GR ha una capacità massima stabilita di accumulo di pigmento. Sono di norma microciti o sferociti. anulocitosi: forma incavata in conseguenza di un difetto primitivo di membrana schistocitosi: frammenti di forma irregolare (patologici nell anemia emolitica immunomediata) 1

2 25/11/14 Corpi inclusi LEUCOCITI (WBC) - globuli bianchi Reticolociti Cellule anucleate giovani che hanno conservato nel citoplasma alcuni ribosomi, mitocondri, reticolo endoplasmatico Un incremento della percentuale relativa di queste cellule è il segno di attività rigenerativa del sangue e di una vivace funzione proliferativa da parte del midollo osseo. Ce ne sono di diversi tipi: linfociti, monociti, basofili, eosinofili, neutrofili. La loro funzione è quella di difendere l organismo dalle infezioni. L esame che evidenzia la percentuale dei diversi globuli bianchi presenti nel sangue si chiama formula leucocitaria. Sono considerati valori fisiologici un numero di in un millilitro cubo di sangue. Sono conteggiati con speciali apparecchi contaglobuli. I globuli bianchi nel sangue periferico formula leucocitaria neutrofili % linfociti % monociti 2-10 % eosinofili 1-6 % basofili <1-2% neutrofili linfociti monociti eosinofili basofili 2-7 x 109/L 1-3 x 109/L x 109/L x 109/L x 109/L monocita neutrofilo eosinofilo Classificazione dei leucociti numeri assoluti basofilo Granulari (granulociti) Presentano voluminose inclusioni citoplasmatiche Si dividono in: Neutrofili Eosinofili Basofili Agranulari (agranulociti) Si distinguono: Monociti Linfociti linfociti LGL Granulociti eosinofili I granuli (specifici, relativamente grandi) si colorano con il colorante acido eosina à g. acidofili Nucleo tipicamente bilobato Rimangono in circolo 6-10 ore, poi migrano nel connettivo, dove sopravvivono 8-12 giorni Non si occupano di fagocitare batteri Eliminano complessi antigene-anticorpo formati nel corso di reazioni allergiche Partecipano alla reazione antiparassitaria Classificazione dei leucociti Granulari (granulociti) Presentano voluminose inclusioni citoplasmatiche Si dividono in: Neutrofili Eosinofili Basofili Agranulari (agranulociti) Si distinguono: Monociti Linfociti 2

3 Monociti Cellule fagocitiche voraci, ardite, in grado di fondersi fra loro in una cellula fagocitaria gigante per aggredire particelle di grandi dimensioni Partecipano alla risposta immunitaria umorale con la presentazione dell antigene LINFOCITI Hanno dimensioni molto variabili (dm 7-18 micron) Queste oscillazioni sono dovute ad una differente quantità di cotoplasma Il nucleo è leggermente più grande di un comune globulo rosso, e di solito presenta un contorno rotondeggiante od ovalare di importanza essenziale per la funzionalità del sistema immunitario dell organismo Linfociti B Una volta attivati dall interazione con l antigene presentato dal macrofagi si trasformano in plasmacellule e producono anticorpi Linfociti T Si distinguono in: T-helper: Coadiuvano i B nella risposta umorale T-citotossici: Secernono sostanze che uccidono cellule infette da virus o cellule estranee (per esempio, dopo trapianti) Linfociti NK Linfociti B, T ed NK Cellule del sistema dell immunità specifica a vita lunga, non terminali, in grado di trasformarsi in linfoblasti e di assumere nuove funzioni in seguito all interazione con l antigene cellule di grandi dimensioni importanti nella risposta immunitaria innata uccidono cellule neoplastiche o infettate da virus Variazioni morfologiche dei leucociti Variazioni del nucleo Inclusioni citoplasmatiche Presenza di parassiti Forme immature Forme miste PIASTRINE Valori superiori alla norma possono essere determinati da infiammazioni o infezioni: se aumentano i neutrofili l'infezione è di natura batterica se aumentano i linfociti è tendenzialmente di origine virale se aumentano quelli eosinofili si può pensare o ad una allergia o ad una infestazione da parassiti. Sono i più piccoli elementi figurati del sangue che contribuiscono alla coagulazione aggregandosi in particolari situazioni (traumi, ferite, emorragie) bloccano le emorragie. La loro aggregazione è un fenomeno sfavorevole quando tende ad avvenire in condizioni normali, perchè può portare alla trombosi. La loro diminuzione causa alterazioni dell'emostasi con allungamento del tempo di emorragia. Sono prodotte nel midollo osseo per frammentazione di grandi elementi cellulari detti megacariociti 3

4 Lo striscio ematico Permette di effettuare il conteggio delle piastrine, la valutazione della morfologia cellulare e la stima numerica dei singoli tipi di cellule È opportuno che sia realizzato entro 15 dopo il prelievo utilizzando il sangue non ancora entrato in contatto con l anticoagulante Deporre una goccia di sangue quasi al bordo del vetrino 1 Avvicinare la goccia con il margine del vetrino 2, inclinato a 30 Il sangue si distribuirà lungo tutto il bordo del vetrino per capillarità La tecnica di Wright-Giemsa Blu di metilene disciolto in alcool ed eosina Il blu di metilene ha ph alcalino e manifesta affinità per i componenti acidi della cellula (nucleo) L eosina ha un ph acido e colora tutti i componenti cellulari basici (emoglobina e granuli eosinofili) Erythrocytes Pink-Tan Eosinophiles Red Lymphocytes: Granules Red-Purple Blue Lymphocytes: Cystoplasm Neutrophils: Granules Purple-Pink Far scorrere il vetrino 2 in avanti con un movimento uniforme, deciso e costante così da stendere la goccia in uno strato sottilissimo Il vetrino deve essere fatto asciugare subito e colorato nel giro di un ora. Valutazione dello striscio ematico Uno striscio di buona qualità deve presentare uno strato di sangue spesso in prossimità di uno dei bordi che si assottiglia gradualmente manmano che ci si sposta verso il bordo opposto, fino a trasformarsi in un monostrato cellulare con un bordo sfrangiato Esame microscopico dello striscio ematico Con una lente a piccolo ingrandimento si effettua una valutazione generale (es. presenza di aggregati piastrinici, parassiti,..) Con una lente a medio ingrandimento si mette a fuoco la parte corrispondente al monostrato cellulare e spostandosi verso la parte più spessa dello striscio Si devono valutare gli eritrociti, contare e classificare almeno 100 leucociti e valutare la morfologia e il numero delle piastrine presenti Esame emocromocitometrico completo Letteralmente significa "misurazione del colore del sangue e del numero delle sue cellule, cioè dei globuli". Comprende: il conteggio degli eritrociti e dei leucociti la determinazione della formula leucocitaria e dell ematocrito la misurazione dell emoglobinemia Il calcolo degli indici derivati Si esegue su sangue in toto anticoagulato, ottenuto da prelievo venoso Grandezze principali e indici derivati ERITROCITI" - Conteggio (n /mm3) " - Ematocrito (%) " - Emoglobina (g/dl) - Indici eritrocitari: MCV (Volume Corpuscolare Medio) MCH (Emoglobina Corpuscolare Media) MCHC (Concentrazione Emoglobinica Corpuscolare Media) LEUCOCITI - Conteggio (n /mm3) - Conteggio differenziale ESAMI AGGIUNTIVI " VES (velocità di eritrosedimentazione) " Conteggio piastrine " Conteggio reticolociti Cosa possiamo sapere dall ESAME EMOCROMOCITOMETRICO? 4

5 ERITROCITI Intervalli di riferimento nell'adulto (1) LEUCOCITI E PIASTRINE intervalli di riferimento nell adulto (2) Parametro Unità Intervallo di riferimento Eritrociti 10 6 /µl M 4,5-5,8 F 4,2-5,4 Emoglobina g/dl M F Ematocrito % M F MCV fl (L -15 ) M/F MCH pg (g -12 ) M/F MCHC g/dl M/F RDW % M/F Reticolociti % M/F 0,2-2 Parametro Unità Intervallo di riferimento Leucociti 10 3 /µl M/F 4-10 Formula leucocitaria: g. neutrofili % M/F g. eosinofili % M/F 1-6 g. basofili % M/F 0-2 linfociti % M/F monociti % M/F 2-10 Piastrine 10 3 /µl M/F Variabilità preanalitica nell ESAME EMOCROMOCITOMETRICO intervalli di riferimento nell infanzia Campione: sangue intero con EDTA Leucociti Granulociti Linfociti totali (10 3 /µl) neutrofili (10 3 /µl) (10 3 /µl) Adulti 4,0-10,0 2,0-5,0 1,5-4,0 Bambini (8-12 anni) 4,5-13,5 2,0-6,0 1,5-6,5 Bambini (4-7 anni) 5,0-15,0 2,0-6,0 5,5-8,5 Bambini (1-3 anni) 6,0-18,0 1,5-8,5 4,0-10,0 Neonati (3 giorni) 4,0-13,0 1,5-7,0 2,0-5,0 Neonati (1 giorno) 10,0-24,0 5,0-13,0 3,5-8,5 Eseguire l esame il più rapidamente possibile o almeno: entro 1 ora: striscio di sangue (poi conservato a T ambiente e colorato entro alcuni giorni). Le cellule che più risentono della conservazione sono i leucociti che possono degenerare. entro 6 ore: VES conteggio piastrine entro 24 ore se il sangue è conservato a 4 C: conteggi eritrociti e leucociti ematocrito emoglobina Conteggio degli elementi figurati (eritrociti, leucociti e piastrine) Per le conte cellulali è necessario usare sangue non coagulato Se la conta non è effettuata nelle 2-3 ore successive al prelievo, il sangue deve essere refrigerato a 4 C (per evitare il rigonfiamento dei globuli rossi) Conteggio dei globuli rossi Le tradizionali tecniche manuali di conteggio dei GR, utilizzando pipette di diluizione e le camere ottiche di conteggio mostravano un errore analitico del 15-20% Valori di riferimento /mmc (millimetro cubo) per l uomo /mmc per la donna /mmc per il neonato /mmc per l infante di 1-2 anni /mmc per il bambino di 3-7 anni /mmc per il ragazzino di 8-12 anni Alla nascita sono molto di più, tra i 7 e gli 8 milioni/mmc, ma dopo pochi giorni scendono ai valori normali. Essendo 5 i litri di sangue, possediamo in totale 25 mila miliardi di globuli rossi: l uno accanto all altro coprirebbero una superficie pari a quella di un campo di calcio! 5

6 Valori superiori a quelli fisiologici possono essere causati da insufficienza respiratoria, da policitemia, da talassemia. Nelle talassemie, l aumento del numero dei GR è persistente e caratterizzato da una microcitosi persistente per tutta la vita, la microcitemia. Valori inferiori a quelli fisiologici possono essere causati da anemie (per riduzione dell eritropoiesi), da crisi emolitiche o da emorragia Fattori preanalitici che contribuiscono ad anomalie della misura Il mantenimento del laccio per più di un minuto nel corso del prelievo provoca emoconcentrazione ed aumento dei valori Fattori che contribuiscono ad alterare i valori I soggetti che vivono ad altitudini elevate dimostrano valori maggiori causato da un adattamento alle condizioni di ipossia ipobarica I fumatori mostrano valori aumentati Emoconcentrazione provocata da diarrea o vomito, provoca aumento dei valori di GR Emodiluizione, es. gravidanza, provoca una diminuzione dei valori di GR Conteggio dei globuli bianchi Costituisce una procedura tuttora eseguita nei lab sia con tecnica manuale che automatica La manuale è eseguita soprattutto per campioni di liquor, liquido sinoviale o essudati che richiederebbero specifici settaggi del sistema automatico Valori di riferimento Leucociti totali Adulto /µL Neonato (<2sett) /µL 6-12 anni /µL 2-6 anni /µL Formula leucocitaria: g. neutrofili 40-60% g. eosinofili 1-4% g. basofili 0,5-1% linfociti 20-40% monociti 2-8% Valori superiori possono essere determinati da infiammazioni o infezioni: se aumentano i neutrofili la infezione è di natura batterica se aumentano i linfociti è tendenzialmente di origine virale se aumentano quelli eosinofili si può pensare o ad una allergia o ad una infestazione da parassiti. Nelle leucemie i globuli bianchi raggiungono picchi altissimi (da 30 mila a centinaia di migliaia) Conteggio delle piastrine Il conteggio delle piastrine è difficile da standardizzare sia con le tecniche manuali e con il conteggio nelle camere, poiché le piastrine sono di piccole dimensioni e tendono ad aggregarsi. I sistemi automatizzati e l uso di materiali monouso di plastica ha migliorato ma non risolto il problema Valori superiori a quelli presi come riferimento possono essere determinati da carcinomi, da carenza di ferro, da troppo esercizio fisico, da infiammazioni, da leucemie, da parto, da policitemia, da splenectomia, da traumi,... Valori di riferimento /µL Fattori che contribuiscono al rilievo di valori anormali: Aumento: Altitudine, temperature fredde, esercizio strenuo Diminuzione: periodo premestruale Valori inferiori a quelli presi come riferimento possono essere determinati da infezioni virali, da leucemia, da linfomi, da trasfusioni, da uso di antibiotici, di diuretici, di ipoglicemizzanti (farmaci per diabetici che abbassano la glicemia stimolando la produzione di insulina da parte del pancreas: sono compresse da prendere per bocca),... 6

7 Contaglobuli automatico Determina il numero delle cellule, le dimensioni delle cellule (MCV) e la concentrazione emoglobinica. Inoltre, durante la conta calcola matematicamente l ematocrito, MCHC e MCH 1) Gli elementi corpuscolati del sangue diluiti in una soluzione elettrolitica, passano attraverso una fessura Principio di funzionamento Le cellule vengono diluite in una soluzione elettrolitica e fatte passare attraverso una fessura. la resistenza elettrica che attraversa la fessura varia a seconda delle dimensioni e del numero di cellule. 2) L elettrodo rileva la resistenza elettrica che attraversa la fessura e che varia a seconda delle dimensioni e del numero di cellule Laser cell counters Sfruttano un sistema di rilevamento ottico laser per misurare le dimensioni e la complessità della struttura interna delle cellule, basandosi sulla rifrazione della luce ottenuta da diverse angolazioni. Asse delle ordinate: dimensione delle cellule Citogramma della perossidasi in un prospetto di Laser cell counters Gli eosinofili e i neutrofili hanno un elevato contenuto di perossidasi e sono localizzati sulla destra, mentre i linfociti che hanno un basso contenuto di perossidasi sono localizzati sulla sinistra. LUC: large unstained cells-grandi cellule non colorate (grandi linfociti, monociti e blasti I monociti hanno scarsa quantità di perossidasi e sono localizzati nella zona tra i neutrofili e i linfociti Asse delle ascisse: Contenuto in perossidasi delle cellule EMOGLOBINA (Hb) Costituente principale dei globuli rossi, con la funzione di trasportare molecole di ossigeno. Ha forma globulare ed è costituita da 4 subunità, ciascuna contenente ferro: l O2 si lega al Fe++ La sua formazione avviene nel midollo osseo simultaneamente a quella degli eritrociti immaturi in un globulo rosso esistono circa 350 milioni di molecole di emoglobina, ciascuna delle quali in grado di trasportare quattro molecole di ossigeno. Costituisce una misura standard dell esame emocromocitometrico e un valore primario essenziale al calcolo degli indici derivati valori di riferimento g/dl uomini g/dl femmine 11,1-14,1 g/dl bambino 1 anno 11,8-15,0 g/dl bambino 10 anni Anziano: lieve diminuzione Gravidanza: lieve diminuzione per diluizione 7

8 Valori superiori a quelli considerati fisiologici possono essere causati da diarrea, da disidratazione, da enfisema, da policitemia, da poliglobulia, da shock, da ustioni, da trasfusioni ripetute Fattori preanalitici che contribuiscono ad anomalie della misura Il mantenimento del laccio per più di un minuto nel corso del prelievo provoca emoconcentrazione ed aumento dei valori di Hb Valori inferiori a quelli ritenuti fisiologici possono essere causati da aplasia midollare, da deficit di ferro, da deficit di vitamina B12, da emorragie, da epatopatie, da infezioni gravi, da insufficienza renale cronica, da leucemie, da metrorragia, da neoplasie maligne. Fattori che contribuiscono ad alterare i valori I soggetti che vivono ad altitudini elevate dimostrano valori maggiori I fumatori mostrano valori aumentati Metodo della Cianmetaemoglobina (HiCN) È il metodo di riferimento di della valutazione della Hb Si basa sulla trasformazione della Hb in HiCN Misura tutte le forme di Hb circolante (tranne la suloemoglobina) attraverso la quantificazione spettrofotometrica a 540 nm dell HiCN. 20 µl di sangue + 5 ml di Soluzione di DRABKIN (ferricianuro + cianuro di potassio) Dopo 5 min di incubazione si valuta la densità ottica di questa soluzione a 540 nm La densità ottica è direttamente proporzionale alla concentrazione di pigmento EMATOCRITO (HCT) EMATOCRITO significa separazione del sangue cioè separazione della parte corpuscolata dal plasma. Valuta la rercentuale della parte corpuscolata (globuli rossi) in relazione al volume totale L ematocrito dipende dal numero e dal volume degli eritroci Nei sistemi automatizzati moderni è stato inserito un modulo analitico che procede alla lisi dei GR e alla quantificazione per spettrofotometria dell emoglobina Un capillare eparinato contenente sangue è centrifugato a 5 per RPM. Si valuta il rapporto tra plasma e globuli rossi sedimentati. La misura dell ematocrito con i contatori automatici viene ottenuta per calcolo a partire da: Vol corpuscolare medio MCV e il conteggio dei GR secondo la formula: Htc=MCV (fl) x GR (milioni/mm3) x1/1000 Valori di riferimento: nell uomo: dal 40-52% nella donna: dal 32-47% Una riduzione dell'ematocrito significa che o la parte corpuscolata del sangue è diminuita (parimenti dovrebbero essersi abbassati anche il numero degli eritrociti e il valore dell'emoglobina) o che la parte liquida (ad esempio per una iperidratazione del corpo) è aumentata. Un aumento dell'ematocrito può significare o un incremento della parte del sangue corpuscolata (poliglobulia) o una diminuzione della parte fluida (disidratazione molto grave del corpo detta ispissatio sanguinis). 8

9 Fattori preanalitici che contribuiscono ad anomalie della misura dell ematocrito Il mantenimento del laccio per più di un minuto nel corso del prelievo provoca emoconcentrazione ed aumento dei valori dal 2,5 al 5% Fattori che contribuiscono ad alterare i valori I soggetti che vivono ad altitudini elevate hanno valori maggiori I fumatori mostrano valori aumentati La gravidanza può causare diminuzione Formule per il calcolo degli INDICI ERITROCITARI DI WINTROBE MCV (Volume Corpuscolare Medio) ematocrito x 10 = µ3 n eritrociti (milioni/mm3) MCH (Emoglobina Corpuscolare Media) emoglobina x 10 = µ µg o pg n eritrociti (milioni/mm3) MCHC (Concentrazione Emoglobinica Corpuscolare Media) emoglobina x 100 = % o g/100 ml ematocrito PARAMETRI BIOMETRICI ERITROCITARI (indici derivati) Gli indici derivati dal numero di GR, dal valore di Hct e dalla concentrazione di Hb presenti nel campione sono essenziali alla valutazione del globuolo rosso. MCV = Mean Corpuscolar Volume, Volume corpuscolare medio: fl Indica la grandezza media del globulo rosso MCH = Mean Corpuscolar Hemoglobin, Concentrazione emoglobinica corpuscolare media: pg Indica il contenuto emoglobinico per singola cellula MCHC = Mean Corpuscolar Hemoglobin Concentration, Ampiezza della distribuzione dei globuli rossi: g/dl Indica la concentrazione media di Hb in un dato volume di GR ERITROPENIA: Anemia Diminuzioni nel numero dei GR Indici di anemia Diminuzione di GR Diminuzione livelli di emoglobina Diminuzione degli indici eritrocitari Cause di anemia Aumentata emocateresi Emorragie Diminuita produzione Malattie infiammatorie croniche Deficienze nutrizionali Malattie emolitiche ERITROCITOSI aumento anomalo del numero dei Globuli Rossi Si verifica nei soggetti con disidratazione, ustioni, policitemia vera. Soggetti che vivono ad altitudini elevate hanno un numero maggiore di globuli rossi in modo da adattarsi alle condizioni di minore disponibilità di ossigeno. 9

10 LEUCOPENIA diminuzione del numero dei globuli bianchi. E spesso associata a infezioni virali o ad agenti terapeutici (radiazioni, farmaci, sost. chimiche). LEUCOCITOSI aumento del numero dei Globuli Bianchi. E spesso associata alla presenza di malattie infettive e di leucemie. La leucocitosi può anche essere fisiologica (esercizio fisico, stress, gravidanza). TROMBOCITOPENIA diminuzione nel numero delle piastrine. Può essere associata a leucemia acuta, infezioni virali, emorragie, radioterapia, chemioterapia. TROMBOCITOSI incremento nel numero di piastrine. Si osserva nella policitemia vera, nelle leucemie croniche, e dopo splenectomia. 10