L utilizzo di una batteria di saggi biologici come contributo alla definizione della qualità dei sedimenti marini

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Luisa Grande
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1 L utilizzo di una batteria di saggi biologici come contributo alla definizione della qualità dei sedimenti marini Dr.Tristano Leoni ARPAM - Dipartimento di Macerata

2 Che cos è un saggio biologico Un saggio biologico è una prova di laboratorio in cui un sistema biologico viene esposto alla matrice da analizzare per un determinato periodo di tempo trascorso il quale vengono valutati gli effetti a carico del sistema biologico stesso.

3 Perché effettuare saggi biologici? Valutano gli effetti tossici della frazione biodisponibile dei contaminanti Forniscono risposte integrate sugli effetti dei contaminanti per gli organismi compresi quelli dovuti ad effetti sinergici, antagonisti ed alle sostanze non analizzate Forniscono risultati che possono integrarsi con i dati relativi alle analisi chimiche ed alle comunità residenti

5 Come progettare un indagine che preveda l esecuzione di saggi biologici

6 1)- La distribuzione dei contaminanti In funzione delle proprietà chimico fisiche delle diverse molecole e dell ambiente esterno, si avrà una loro ripartizione preferenziale: nella colonna d acqua nell interfaccia acqua/sedimento nell acqua interstiziale sulla superficie dei granuli del sedimento.

7 2)- Le risposte biologiche Determinati inquinanti manifestano tossicità solo verso poche specie animali e/o vegetali mentre altri possono farlo verso più specie, ma in questo caso spesso a livelli di concentrazione differenti.

8 L approccio migliore multimatrice multispecie

9 Batteria di saggi utilizzata ORGANISMO MATRICE ANALIZZATA Sedimento centrifugato Acqua interstiziale Elutriato acquoso Vibrio f. / Paracentrotus l. Dunaliella t. / / / /

10 Preparazione del campione Sedimento tal quale Centrifugazione x g (4 C) Omogenizzazione Calcolo umidità Diluizione 1:4 v/v Centrifugazione 8000 x g (4 C) ACQUA INTERTIZIALE Vibrio f. in fase acquosa SEDIMENTO CENTRIFUGATO Vibrio f. in fase solida ELUTRIATO ACQUOSO Dunaliella t. ELUTRIATO ACQUOSO Paracentrotus l.

11 Saggio di tossicità acuta con Vibrio fischeri: Principi Generali batterio marino luminescente emissione mediata dall enzima luciferasi intensità emissione proporzionale all entità del metabolismo energetico alterazione del metabolismo e quindi dell emissione luminosa (decremento o incremento) da parte di sostanze tossiche possibilità di analisi su fasi liquide e solide L effetto viene rilevato e quantificato con un luminometro dopo 5 30 minuti di esposizione alla matrice da saggiare a 15 C.

12 Saggio di tossicità acuta con Vibrio fischeri in fase liquida: principi generali I risultati vengono calcolati con la seguente espressione: Γ = A / 1-A dove A = frazione di luminescenza persa rispetto al controllo (1-A) = luminescanze residua rispetto al controllo Γ = 0 nessuna risposta Γ = 1 50% di risposta Costruzione della curva dose risposta riduz. Biolum - gamma EC 50 Concentrazione Individuazione della EC 50 EC 20 con relativi L.F. Calcolo delle U.T. [(1 / EC50) x 100]

13 Saggio di tossicità acuta con Vibrio fischeri in fase solida: La correzione pelitica Il saggio in fase solida viene eseguito sulla frazione granulometrica < 1mm La componente naturale della tossicità è funzione della frazione pelitica (< 63 µ) Difficoltà di reperire un sedimento di riferimento frazione <63 µ frazione 63 µ - 1 mm Y = stima della tossicità naturale in T.U. X = % pelite

14 Saggio di tossicità acuta con Vibrio fischeri in fase solida: Una scala di tossicità Il Sediment Toxicity Index (ICRAM 2000) S.T.I 0 STI 1 1< STI 3 3< STI 6 6< STI 12 > 12 assente lieve media alta molto alta Tossicità

15 Saggi sull alga unicellulare Dunaliella tertiolecta: Principi Generali confronto tra la crescita di alghe di una data specie in un mezzo di coltura che funge da controllo e nella matrice da saggiare sostanza o matrice da saggiare tal quale o in più diluizioni in mezzo di coltura sempre in più repliche (3-5) Condizioni del saggio: 25 C, illuminazione continua a lux Valutazione dell effetto (inibizione o anche stimolazione della crescita) dopo 96 ore max. Metodi di misura della crescita: Conta al microscopio, conta particelle eletronici, spettrofotometria

16 Saggi sull alga unicellulare Dunaliella tertiolecta: Espressione dei risultati Percentuale di effetto rispetto al controllo se saggio solo su T.Q. (t di Student o equivalente non parametrico) Costruzione della curva dose effetto e calcolo della EC 50 (probits) Calcolo della NOEL (Dunnet o equivalente non parametrico) I saggi algali sono a volte inclusi tra i saggi acuti. Essi sono in effeti saggi cronici in quanto il tempo di esposizione (96 ore) è relativamente lungo rispetto al ciclo vitale (10 ore circa) inibiz. crescita EC 50 Concentrazione EC 50

17 Saggio di fecondazione e sviluppo embrionale con Paracentrotus lividus Echinoderma Specie residente, prelevata in situ ed acclimatata in acquario prima del saggio Elevata sensibilità ai tossici End point caratteristici, rilevanti Relativamente complicato

18 Matrici: acqua interstiziale, elutriati, soluzioni di tossici una o più diluizioni ( più controllo) almeno in triplo Emissione di gameti, dopo scuotimento o inezione nella cavità celomatica di KCl 0.1M Pre trattamento in vitro dei gameti maschili con la matrice da analizzare per 20 Introduzione nel sistema in vitro di gameti femminili (rapporto spermi uova 1:20000 circa) Fecondazione per 60 Blocco della fecondazione con formalina Valutazione microscopica del % di fecondazione rispetto al controllo su almeno 200 uova per ogni diluizione Eventuale calcolo di EC 50 ed U.T. Saggio di fecondazione

19 Saggio di sviluppo embrionale Prolungamento del tempo di fecondazione a 24 ore Blocco della fecondazione con formalina Valutazione delle malformazioni su almeno 200 embrioni: Quantitativa: n totale di malformazioni Qualitativa: n di malformazione specifiche

21 Vibrio f. -solido Vibrio f. - liquido S.T.I Tossicità Riduzione % bioluminescenza Tossicità 0 STI 1 assente -10 d 10 assente 1< STI 3 lieve 10< d 20 lieve 3< STI 6 media 20< d 40 media 6< STI 12 alta 40< d 80 alta > 12 molto alta d > 80 molto alta Dunaliella t. - liquido Paracentrotus l. - liquido Inibizione % crescita algale Tossicità Inibizione % fecondazione Tossicità > 20 presente > 8 presente

22 Vibrio f. - Sediment Toxicity Index (STI) tronto chienti esino conero foglia ,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 foglia conero esino tronto chienti

23 CHIENTI analisi in fase liquida % effetto vibrio - acqua int % effetto dunaliella - elutr. % effetto paracentrotus - elutr

24 CONERO - analisi in fase liquida % effetto vibrio - acqua int % effetto dunaliella - elutr. % effetto paracentrotus - elutr

25 ESINO - analisi in fase liquida % effetto vibrio - acqua int % effetto dunaliella - elutr. % effetto paracentrotus - elutr

26 FOGLIA - analisi in fase liquida % effetto vibrio - acqua int % effetto dunaliella - elutr. % effetto paracentrotus - elutr

27 TRONTO - analisi in fase liquida % effetto vibrio - acqua int % effetto dunaliella - elutr. % effetto paracentrotus - elutr

28 Vibrio f. Unità Tossiche (UT) tronto chienti esino conero foglia ,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 foglia conero esino tronto chienti

29 Dunaliella t. Unità Tossiche (UT) tronto chienti esino conero foglia ,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 foglia conero esino tronto chienti

30 Paracentrotus l. Unità Tossiche (UT) tronto chienti esino conero foglia ,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 foglia conero esino tronto chienti

31 CRITICITÀ RISCONTRATE Unità di misura Scarsa uniformità procedurale tra le varie Regioni Difficoltà di reperire specie autoctone sensibili a diffusione nazionale

32 PROPOSTE PER IL FUTURO Ottimizzazione batteria di saggi Interpretazione ed integrazione dei risultati

33 INTEGRAZIONE DEI RISULTATI - 1 Biotest 2 Biotest 1 Biotest 3

34 ? Sicuramente positivo Test 3 Test 2 65 Test Sicuramente negativo

35 INTEGRAZIONE DEI RISULTATI 2 Sediment Quality Triad (SQTA)

38 Ringraziamenti G. De Grandis, F. Principi: per tutte le attività di campionamento in mare A. Renzi: per l impegno nella puntuale fornitura di Paracentrotus utilizzato nei saggi B. Principi, E. Moranti: per la disponibilità a verificare le concentrazioni dei nostri indispensabili tossici di riferimento L. Liuti, S. Sarcina, A. Valenti: per la passione e l impegno con cui si dedicano all Ecotossicologia

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