Metodi di studio delle interazioni proteina-proteina. Metodi genetici basati su split proteins

Transcript

1 Metodi di studio delle interazioni proteina-proteina Metodi genetici basati su split proteins

2 Sistema a doppio ibrido E un metodo genetico che usa l attività trascrizionale come misura dell interazione proteina-proteina in vivo Gli attivatori trascrizionali sono proteine caratterizzate da un dominio che lega il DNA (BD) e un dominio che attiva la trascrizione (AD) Il dominio che lega il DNA serve per indirizzare il dominio attivatore sul gene che deve essere trascritto mentre il dominio attivatore viene a contatto con il complesso trascrizionale

3 Il fattore di trascrizione Gal4 può essere separato in una unità capace di legare il DNA e una unità in grado di attivare la trascrizione. 147 residui N-terminali codificano per il DNA binding domain (DB) o bait 114 residui C-terminali codificano per il dominio che attiva la trascrizione (AD) o prey UAS Per attivare la trascrizione, i due domini non devono necessariamente essere legati covalentemente, ma possono essere messi a contatto dall interazione di altre due proteine X ed Y (Field e Song, 1989)

4 Costruzione dei due ibridi il DNA del binding domain deve essere fuso al DNA della proteina X il DNA dell activation domain deve essere fuso al DNA della proteina Y le due chimere devono essere espresse in una cellula in cui sono presenti uno o più geni reporter X Y Se X ed Y interagiscono si ha la ricostituzione funzionale dell attivatore trascrizionale che attiva l espressione del gene reporter

5 I due vettori che contengono GAL4 binding domain fuso alla Bait protein e GAL4 activation domain fuso alla target protein

6 Applicazione Capacità di isolare rapidamente nuovi geni. E possibile preparare delle library di cdna fuse al dominio di attivazione AD da introdurre in ceppi che esprimono DNA-binding domain fusi alla proteina d interesse. Limiti Non è possibile studiare l interazione di proteine di membrana o di DNA binding protein che da sole hanno la capacità di attivare la trascrizione

7 Split ubiquitin membrane-based yeast two hybrid system L ubiquitina è una proteina di 76 amminoacidi che partecipa al turnover proteico L estremità C-terminale dell ubiquitina forma un legame ammidico con la proteina che deve essere degradata UBPs ubiquitin-specific proteases idrolizzano il legame peptidico tra la proteina condannata e l ubiquitina

8 L ubiquitina può essere espressa in due frammenti: Nub N-terminal fragment (1-34) Cub C-terminal fragment (35-76) che possono riassociarsi a formare l ubiquitina Costruzione dei due ibridi Al 5 del DNA di Cub è fuso il cdna della proteina X Al 3 di Cub è fuso il cdna di TF Al 5 del DNA di Nub è fuso il DNA della proteina Y NubG ha una mutazione puntiforme (Ile13Gly) che non permette l associazione spontanea con Cub. L associazione avviene solo quando le due proteine fuse (X e Y) interagiscono

9

10 Nub e Cub devono essere legate alla regione della proteina di membrana che si localizza nel citosol perchè la proteasi è localizzata nel citosol Pertanto non si può studiare l interazione tra due proteine che hanno entrambe le regioni C-terminali nel lumen del reticolo endoplasmatico E possibile avere informazioni sull orientamento della regione N e C terminale delle proteine di membrana

11 Protein Complementation Assay la proteina reporter è separata in due frammenti i frammenti sono fusi geneticamente ai potenziali partner dell interazione il folding della proteina reporter è mediato dall interazione delle proteine partner

12

13 Enzimi Il folding indotto dall interazione delle proteine partner porta al ripristino dell attività enzimatica Beta galattosidasi, diidrofolato reduttasi (DHFR) o beta-lattamasi Disponibilità di substrati permeabili cromogenici

14 La catalizza la riduzione del diidrofolato in tetraidrofolato importante per la biosintesi dei nucleotidi L interazione tra le proteine partner è evidenziata: 1. sopravvivenza di cellule DHFR - seminate su terreni privi di nucleotidi 2. saggio fluorescente in presenza di fmtx (Methotrexate) fmtx lega con elevata affinità DHFR K d = 540 pm

15 Beta-lattamasi enzima monomerico di 29 kda Può essere scisso in due frammenti e che possono ricostituirsi L interazione tra le proteine partner può essere evidenziata misurando la resistenza all ampicillina RCONH S CH 3 saggio colorimetrico con nitrocefina N CH 3 O COOH Penicillins

16 Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) Il folding della proteina fluorescente indotto dall interazione delle proteine partner porta alla formazione del cromoforo

17 Struttura della GFP (Green Fluorescent Protein) di Aequorea victoria

18 Formazione del cromoforo

19 Importanza del glutammico 222

20 GFP è separata tra i residui 157 and 158 per produrre due frammenti non fluorescenti NGFP e CGFP.

21 L interazione può essere visualizzata in vivo Non è necessario sovraesprimere le proteine E possibile visualizzare interazioni deboli e transienti La visualizzazione dell interazione proteina-proteina non è in tempo reale La multicolor bimolecular complementation assay permette la simultanea visualizzazione di complessi proteici nella stessa cellula

22 Altre varianti di GFP split

23

24

25 FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Trasferimento non radiativo di energia (dipolodipolo) da parte di un donatore fluorescente ad un accettore fluorescente. Il trasferimento di energia dipende da: proprietà spettrali orientamento distanza tra donatore e accettore (1-10 nm)

26 Lo spettro di assorbanza del donatore e lo spettro di eccitazione dell accettore devono essere parzialmente sovrapposti E = efficienza di trasferimento r = distanza tra cromofori = resa quantica = efficienza di conta R 0 = distanza alla quale avviene il 50% del trasferimento di energia; è specifica per ogni coppia di fluorofori

27 Applicazioni della FRET Interazioni proteina-proteina in vitro e cambiamenti conformazionali di proteine Interazioni proteina-proteina in vivo

28 Analisi delle modifiche conformazionali della subunità ε della F0 F1 ATPasi mediante FRET F0 è un canale protonico costituito da tre tipi di subunità a, b, c nelle seguenti quantità ab 2 c F1 catalizza la sintesi di ATP ed è costituito da nove subunità α 3 β 3 γδε ogni subunità β ha un sito catalitico per la sintesi di ATP La subunità γ è l asse centrale

29 L enzima è costituito da due parti una mobile costituita da c e da γε in grado di ruotare e una unità immobile o statore costituito dal resto della molecola

30 Mediante FRET è stato dimostrato che le due alfa eliche di ε cambiano conformazione passando da una forma estesa HIGH FRET ad una forma ritratta LOW FRET in presenza di ATP

31 Espressione di α 3 β 3 εγ

32 Assorbe a 530 nm ed emette a 570 (615) nm Assorbe a 625 nm ed emette a 670 nm I due fluorofori sono stati coniugati ad una cisteina della proteina mediante reazione con maleimide

33 Spettri di fluorescenza di linea tratteggiata linea punteggiata Assorbe a 530 nm ed emette a 570 nm Assorbe a 649 nm ed emette a 670 nm linea continua

34 In vivo BRET, Bioluminescence Resonance Energy Transfer FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer La visualizzazione avviene mediante microscopia o mediante lettori di micropiastre in fluorescenza

35

36

37 La bioluminescenza è un fenomeno osservato in natura, ad esempio nelle lucciole, Photinus pyralis. Questa manifestazione naturale deriva dalla reazione tra l enzima luciferasi e il suo substrato luciferina e l ATP. La luce è prodotta dall ossidazione della luciferina in presenza di ATP

38 Studio dell'interazione fra due proteine mediante BRET. Alla proteina A viene legato un donatore bioluminescente (luciferasi), alla proteina B un accettore fluorescente (GFP). L'aggiunta della luciferina determina l'emissione di bioluminescenza: -in assenza di interazione proteina-proteina si osserva l'emissione dell ossiluciferina con un massimo a 480 nm; -in presenza di interazione si osserva anche l'emissione della GFP a 530 nm dovuta al processo di trasferimento di energia L'efficienza del trasferimento di energia viene misurata dal rapporto tra l'emissione dell'accettore e quella del donatore

39 Il principale vantaggio di FRET rispetto a BRET è permettere la visualizzazione in una singola cellula di interazioni proteina proteina mediante osservazione al microscopio Svantaggi In FRET il fluoroforo deve essere eccitato da luce monocromatica che può eccitare anche il fluoroforo accettore L eccitazione del donatore mediante illuminazione del campione può determinare photobleaching sbiancamento dell accettore con conseguente perdita del segnale L illuminazione induce autofluorescenza di componenti endogene determinando background che complica l interpretazione dei dati

40 Analisi del complesso ternario dei fattori di trascrizione AP-1 e NFAT BiFC-FRET tra Cerulean e Venus, due varianti di CFP e YFP. NFAT1 è un fattore di trascrizione richiesto per lo sviluppo delle cellule T e forma un complesso con il fattore AP-1 (eterodimero Jun-Fos). La regione leucine zipper di Jun e Fos è fusa alle regioni N- e C- terminale di Venus (BiFC). L interazione con NFAT1 produce FRET tra Cerulean e Venus ricostituita.