FLUORESCENZA. 1. Emissione di radiazioni di una molecola che torna

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1 FLURESCENZA allo stato fondamentale da uno stato elettronico 1. Emissione di radiazioni di una molecola che torna eccitato 2. L emissione è spostata verso il rosso rispetto alla eccitazione (= lunghezza d onda maggiore). 3. Si possono misurare i seguenti parametri: a. Spettri di eccitazione ed emissione b. Intensità di fluorescenza c. Tempo di emivita d. Polarizzazione

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4 Intensità di fluorescenza, I f e misure di concentrazioni I f = 2.3 I 0 ε d c Φ f Φ = resa quantica = f fotoni emessi fotonia assorbiti 0 Φ 1

5 Relazione tra concentrazione e fluorescenza smorzamento (quenching)

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7 (ioni Cu ++, Ni ++, Co ++ )

8 Identikit di molecola fluorescente 1. deve avere uno spettro di assorbimento (un elettrone n o π che raggiunga uno stato eccitato) 2. lo stato eccitato deve avere un tempo di vita 3. deve essere una molecola planare 4. la molecola è aromatica

9 Biomolecole fluorescenti: H 2 N CH C H H 2 N CH C H H 2 N CH C H CH 2 CH 2 CH 2 HN H triptofano tirosina fenilanina H 2 N C NH H H H H H H P - P - H H H N N H H H NH 2 N N clorofilla beta-carotene NADH porfirine

10 Diagramma di uno spettrofotofluorimetro Sorgente Σλ ex Monocromatore di eccitazione λ ex Σλ em λ em campione Monocromatore di emissione Rivelatore

11 devono essere contenuti in

12 Effetti pre-filtro e postfiltro pre post microcuvetta pre = assorbimento luce incidente post = assorbimento luce emessa Entrambi i casi si risolvono diluendo il campione o utilizzando microcuvette

13 Fluorimetri per micropiastre tempi di lettura: 96 pozzetti in 15s limiti di rilevazione: 10 am lampada allo xenon (flash lamp)

14 Principali applicazioni della fluorescenza 1. Misure di spettri 2. Analisi qualitative (immunofluorescenza) 3. Analisi quantitative a. Dosaggi enzimatici b. legame con recettori c. legame con anticorpi (DELFIA) 4. Studi di struttura e funzione delle proteine mediante trasferimento di energia (FRET) 5. Misure di quenching 6. Sonde fluorescenti e struttura/viscosità delle membrane 7. Biosensori

15 Spettri in soluzione spettro di eccitazione: scansione del monocromatore di eccitazione fissa lunghezza d onda di emissione spettro di emissione: scansione del monocromatore di emissione fissa lunghezza d onda di eccitazione monocromatore = selettore di lunghezza d onda

16 L emissione di luce fluorescente avviene secondo uno spettro di energie e a lunghezza d onda maggiore di quella di eccitazione La differenza di energia tra i picchi massimi è detta spostamento di Stokes spostamento di Stokes = 25 nm Fluoresceina 495 nm 520 nm Fluorescenza lunghezza d onda

17 1. Lo spettro di emissione e la λ max non dipendono dalla λ ecc 2. La intensità di fluorescenza dipende dalla λ ecc

18 Dosaggio della fosfatasi alcalina CH 3 CH 3 P H H metilumbelliferone-fosfato H - H metilumbelliferone + fosfato si segue il decorso della reazione eccitando a 365 nm e misurando la fluorescenza a 450 nm

19 Fluorescent Proximity Assay peptide con quenciante (Qu) Qu Qu Ga 3+ P 4 Ga Ga Ga 3+ ATP ADP 4 P Ga 3+ Qu 3+ Ga Saggio per chinasi e fosfatasi 1. Si basa su microsfere rivestite di polimeri fluorescenti e un metallo (gallio) in grado di chelare il fosfato. 2. I substrati sono marcati con un agente smorzante (quencher). 3. Se il peptide è fosforilato si lega alle sferette. 4. Si possono saggiare inibitori (farmaci) 5. valido per screening e sistemi automatizzati

20 Fluorescenza dei lantanidi (europio, samario, terbio, disprosio) Chelato Excit. (nm) Emission (nm) Fluorescenza vita media (τ) (µsec) Suggested Emission Filter Europium (Eu) /40 Samarium (Sm) /40 Terbium (Tb) /40 *(Dyprosium (Dy) /15

21 eccitamento mediato da composti organici chelanti europio

22 Time-resolved fluorescence Strumentazione: fluorimetro con lampada allo xenon che produce un flash di 2-5 μsec Misure: composti con vita di fluorescenza > 20 μsec

23 DELFIA, Delayed Enhanced Lanthanide Fluorescence Immuno Assay Anticorpi: Si usano anticorpi chelati con Eu 3+ mediante agenti alchilanti come l ITC- DTPA, acido 1-(p-isotiocianatobenzil) dietilentriamina pentacetico, che reagisce facilmente con i gruppi aminici delle proteine. Incubazione: ph 3.2 (dissociante) + dichetone per la cattura del lantanide

24 Fluorescenza per Trasferimento di Energia per Risonanza (FRET) Sovrapposizione degli spettri di donatore ed accettore Molecola 1 Molecola 2 Fluorescenza DNATRE ACCETTRE Fluorescenza Intensità Assorbimento Assorbimento Lunghezza d onda

25 Equazione di forster

26 Principali applicazioni della FRET 1. Cambiamenti conformazionali di proteine 2. Interazioni proteina-proteina 3. Dosaggi di attività enzimatiche 4. Interazioni DNA-DNA (sonde e biosensori)

27 FRET con proteine fluorescenti Aequorea victoria GFP, Green Fluorescent Protein

28 Caratteristiche della GFP a. 238 aa, PM 27kDa. Cristallizza come dimero. b. Eccitazione a 395 e 470 nm (resa quantica = 0.8) c. Emissione a 509 nm d. Utilizzata come gene reporter in Biologia Molecolare e. Utilizzata in dosaggi enzimatici. Non richiede l aggiunta di substrati

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30 Varianti della GFP prodotte per ingegneria genetica gruppo fluoroforo YFP = Ala 206 sostituita da una lisina Ala206

31 proteina di fusione GFP gene di fusione per proteina ibrida

32 Saggio di proteine chinasi con FRET sequenza consenso riconosciuta dalla PKA dominio di legame della fosfatidilserina IFP

33 Interazioni DNA-DNA (sonde e biosensori) FRET no FRET

34 Sensore per AMP ciclico (camp( camp) 1. generato per fusione genetica di ebfp (variante della GFP che emette luce blu) alla subunità regulatoria (R) della PKA ed egfp (variante della GFP che emette luce verde) alla subunità catalitica (C) della PKA. 2. In condizioni di basso camp i due fluorofori sono molto vicini e se eccitati a 380 nm solo una parte della luce è emessa come blu mentre il resto è trasferito alla egfp (FRET), che quindi emette luce verde. 3. Se il camp si lega alla subunità R, la variazione conformazionale abolisce la FRET poiché i due fluorofori sono separati. Allora, l eccitazione a 380 nm dà solo luce blu. Le subunità PKA R e C sono rispettivamente in giallo e arancio

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37 DCFH-DA DCFH DCF 2,7 -diclorofluorescina diacetato CH3-C- -C-CH3 Cl H Cl CH 2,7 -diclorofluorescina H H Esterasi cellulari Cl H Cl CH 2,7 -diclorofluoresceina H DCFH-DA Idrolisi H 2 2 ssidazione Cl H Cl CH DCFH-DA DA DCFH DCF H 2 2 Fluorescente

38 Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Si usa una energia intensa (laser) per esaurire un fluoroforo Cellule muscolari embrionali in coltura

39 sservare la zona buia (foto-sbiancata) nel tempo... La fluorescenza ricompare nella regione sbiancata