Volumetria e pesate Misure di peso Misure di Capacità Misura del ph Tamponi biologici

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Romeo Castelli
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1 Volumetria e pesate Misure di peso Misure di Capacità Misura del ph Tamponi biologici IL MATERIALE CONTENUTO IN QUESTE DIAPOSITIVE E AD ESCLUSIVO USO DIDATTICO PER L UNIVERSITA DI TERAMO

SCEGLIERE LO STRUMENTO ADEGUATO PER EFFETTUARE UNA PESATA: 1) BILANCIA TECNICA è uno strumento che misura la massa di un oggetto con una precisione di ±0.05 grammi.

2 SCEGLIERE LO STRUMENTO ADEGUATO PER EFFETTUARE UNA PESATA: 1) BILANCIA TECNICA è uno strumento che misura la massa di un oggetto con una precisione di ±0.05 grammi. La bilancia tecnica viene generalmente usata per lavori di tipo preparativo (nei quali un errore di ±0.05 grammi sia accettabile)

2) BILANCIA ANALITICA Una bilancia analitica è uno strumento molto sensibile, molto più prono ad errori dati dalle condizioni al contorno rispetto alla

3 2) BILANCIA ANALITICA Una bilancia analitica è uno strumento molto sensibile, molto più prono ad errori dati dalle condizioni al contorno rispetto alla bilancia tecnica e che richiede molta più attenzione nell utilizzo. La bilancia analitica misura la massa di un oggetto con una precisione di ± g (±0.05 mg)

1) Controllare tutte le condizioni che potrebbero falsare la vostra misura: La bilancia potrebbe darvi una falsa lettura a causa di correnti d aria se gli sportelli rimangono aperti o se qualcuno è

4 1) Controllare tutte le condizioni che potrebbero falsare la vostra misura: La bilancia potrebbe darvi una falsa lettura a causa di correnti d aria se gli sportelli rimangono aperti o se qualcuno è appoggiato sul tavolo della bilancia!!! 2) CONTROLLARE CHE LA BILANCIA SIA IN BOLLA!!! 3) Chiudere tutti gli sportelli della bilancia. UTILIZZO 4) Spingere il tasto TARA ed aspettare che la lettura si stabilizzi a g

5) Inserire il campione da pesare al centro del piatto 6) CHIUDERE LO SPORTELLO 7) Una volta che la lettura si è stabilizzata, annotare valore ed errore NB Il risultato

5 5) Inserire il campione da pesare al centro del piatto 6) CHIUDERE LO SPORTELLO 7) Una volta che la lettura si è stabilizzata, annotare valore ed errore NB Il risultato di ogni misura sperimentale va riportato in un quaderno di laboratorio utilizzando la notazione scientifica: Misura = valore ± errore [Unità di misura] Es. m=4.50 ±0.05 g

6 L'unità di misura delle capacità, il litro, è legata all'unità di misura dei volumi; infatti capacità e volume sono due parole che ci servono per indicare la stessa cosa; Il litro corrisponde alla capacità di un decimetro cubo 1l=1 dm 3 1ml=1cm 3!!! Massa e volume sono grandezze direttamente proporzionali: m=rv Dove r è la densità della sostanza. Per l acqua T=10 C r= g/cm T=20 C r= g/cm 3 =>Quanto pesa 1 ml di acqua?

MISURA DI CAPACITA MATRACCI (o palloni volumetrici ) A volume fisso: il fondo del menisco del liquido deve essere tangente alla tacca di calibrazione (attenzione agli errori

7 MISURA DI CAPACITA MATRACCI (o palloni volumetrici ) A volume fisso: il fondo del menisco del liquido deve essere tangente alla tacca di calibrazione (attenzione agli errori di parallasse!) CILINDRI GRADUATI Hanno minore accuratezza, ma permettono la misura di frazioni del volume totale del cilindro (incertezza= 20% di ogni divisione) SBAGLIATO!

8 Pipette GRADUATE (volumi compresi tra 1 e 25 ml) PREISTORIA STORIA Pipet-aid:

Pipette automatiche: ACCORGIMENTI guardare sempre il puntale per controllare di aver preso l intero volume di liquido desiderato Non asciugare mai il puntale con carta assorbente.

9 Pipette automatiche: ACCORGIMENTI guardare sempre il puntale per controllare di aver preso l intero volume di liquido desiderato Non asciugare mai il puntale con carta assorbente. L azione capillare potrebbe farvi perdere parte del liquido. Usare puntali nuovi quando cambiate reagente NON contaminate il reagente di stock con pipette usate con altri reagenti!!! Le pipette possono essere usate per mischiare campioni ma fate attenzione che le soluzioni non tocchino il corpo della pipetta per non contaminarla Non appoggiate la pipetta in orizzontale quando avete liquido nel puntale!

10 Il ph metro Strumento con una sonda - generalmente un elettrodo a vetro (dunque FRAGILE!!!) - che misura la differenza di potenziale elettrico (ddp) su due lati di una sottile membrana di vetro posta all'estremità dell'elettrodo. Tale differenza di potenziale è legata alla differenza tra le concentrazioni degli ioni idrogeno (H + ) all'interno e all'esterno della membrana. (Un'unità di ph generalmente produce una differenza di potenziale di circa 0,059 V.)

11 CALIBRAZIONE A seconda del tipo di phmetro (leggere le istruzioni!!) si costruisce una RETTA DI TARATURA con 2 o 3 punti di ph mediante soluzioni STANDARD (di solito ph 4, ph 7 e ph 9). Per una taratura a 2 punti: 1) rimuovere l elettrodo dalla soluzione di mantenimento (KCl 3M) 2) sciacquarlo abbondante con una spruzzetta (contenente H 2 O!!!) 3) Spingere il pulsante CAL 4) Immergere l elettrodo nel primo standard (ph 4) 5) Attendere che la misura si stabilizzi 6) Sciacquare l elettrodo 7) Immergere l elettrodo nel secondo standard (ph 7) 8) Attendere che la misura si stabilizzi Alla fine, comparirà la schermata con il valore del coefficiente di correlazione della retta ottenuta FINITA LA CALIBRAZIONE, sciacquare abbondantemente e procedere alla misura

12 IMPORTANZA DELLA STABILITA DEL ph Molte molecole biologiche sono particolarmente sensibili al ph del mezzo, sia per quanto riguarda la loro attività, sia la loro stabilità. Velocità di reazione ed equilibrio chimico dipendono spesso dal ph. L'attività degli enzimi si esplica quasi sempre entro limiti di ph molto ristretti (ph ottimale). Il ph del sangue deve essere mantenuto entro limiti abbastanza rigidi. Il valore normale nel sangue arterioso è 7.41: già a valori inferiori a 7.38 e superiori a 7.45, i patologi parlano rispettivamente di acidosi e alcalosi. Se queste condizioni non vengono compensate, si può andare incontro a tutta una serie di manifestazioni patologiche, fino al coma. Valori di ph inferiori a 7 e superiori a 7.8 sono incompatibili con la vita.

13 In Biochimica si usano tamponi in praticamente tutte le soluzioni che saranno usate per gli enzimi o dove il controllo del ph è un parametro importante. Un sistema tampone è GENERALMENTE una mistura di un acido debole e della sua base coniugata (o sale) che permette alle soluzioni di resistere a variazioni di ph. ES. Tampone acido: la costante di EQUILIBRIO di un acido debole (AH) è: K a =[A - ][H + ]/[AH]; equazione di Henderson-Hasselbach: ph = pk a + Log ([A - ]/[HA]) il potere tamponante raggiunge il suo valore massimo quando il ph della soluzione tampone corrisponde al pk a, condizione che si realizza quando la concentrazione dell acido e della sua base coniugata sono uguali; l intervallo utile di ph di un tampone è generalmente considerato pari a pk a ± 1. Al di fuori di questo intervallo non c è una quantità di acido debole o base debole sufficiente ad assorbire le aggiunte di ioni OH - o di ioni H + ; la capacità tamponante aumenta all aumentare della concentrazione dell acido e della sua base coniugata presenti nel tampone, dato che l aggiunta di ioni OH - o di ioni H + determina una variazione inferiore della concentrazione dell acido e della sua base coniugata.

14 pka Value and Buffer Range of important Biological Buffers sorted alphabetically pka 25 C effective ph range buffer acetate ammonium hydroxide borate 9.23, 12.74, carbonate (pk1) carbonate (pk2) citrate (pk1) citrate (pk2) citrate (pk3) glycine (pk1) glycine (pk2) histidine 1.70, 6.04, imidazole methylamine MOPS phosphate (pk1) phosphate (pk2) phosphate (pk3) pyrophosphate 0.91, 2.10, 6.70, TES triethanolamine (TEA) Trizma (tris)

15 METODO PRATICO PER LA PREPARAZIONE DI UNA SOLUZIONE TAMPONE Una soluzione tampone si prepara aggiungendo in soluzione un acido (base) debole ed un sale della sua base (acido) coniugata. ES. Preparazione di 1 litro di tampone sodio acetato 100 mm, ph 5.0 SALE: sodio acetato Acido: acido acetico PESARE LA QUANTITÀ NECESSARIA DI SALE PER AVERE LA MOLARITÀ RICHIESTA; SCIOGLIERE IN UN VOLUME DI H 2 O (DISTILLATA O BIDISTILLATA, A SECONDA DELLA PUREZZA RICHIESTA DALLA TECNICA SPERIMENTALE) MINORE DEL VOLUME FINALE, AIUTANDOSI CON UN ANCORETTA MAGNETICA SULL AGITATORE POSTO IN PROSSIMITÀ DEL PH METRO LEGGERE IL PH ED AGGIUSTARLO AGGIUNGENDO GRADUALMENTE CON UNA PIPETTA PASTEUR L ACIDO ACETICO PORTARE A VOLUME CON UN MATRACCIO OD UN CILINDRO

16 NB UN TAMPONE BIOLOGICO PUÒ CONTENERE ALTRE MOLECOLE CON FUNZIONI STABILIZZANTI QUALI AD ESEMPIO ZUCCHERI (IL SACCAROSIO HA AD ESEMPIO FUNZIONE DI CRIOPROTETTORE: AIUTA A PRESERVARE LA STRUTTURA E LA FUNZIONE DEGLI ENZIMI IN PROCESSI DI CONGELAMENTO/SCONGELAMENTO MOLECOLE CHELANTI I METALLI. AD ESEMPIO EDTA/EGTA SONO ACIDI CHELANTI IL CALCIO (ED IL MAGNESIO) CHE VENGONO AGGIUNTI ALLE SOLUZIONI TAMPONE PER INATTIVARE ENZIMI METALLO-DPENDENTI CHE POTREBBERO DANNEGGIARE DNA O PROTEINE.

17 Problema Preparare V=250 ml del seguente tampone : 50 mm Tris- HCl 1% BSA ph 7.4 Problema Preparare V=300 ml del seguente tampone : 2 mm Tris-EDTA da una soluzione madre 1 M 3 mm MgCl 2 5 mg/ml BSA 50 mm PMSF

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