Voltammetria (Polarografia)
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- Gilberto Arcuri
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1 Voltammetria (Polarografia) Introdotta da Heyrovsky nel 1920 mediante l uso dell elettrodo a goccia di mercurio come elettrodo di lavoro (polarografia) Viene applicata una differenza di potenziale in modo variabile al fine di far avvenire una reazione redox all elettrodo di lavoro. Dalla curva i-v è possibile estrapolare l informazione analitica (concentrazione). Le tecniche voltammetriche si distinguono per il tipo di potenziale applicato all elettrodo e sono tra le più sensibili. Consente l analisi qualitativa e quantitativa di cationi, anioni e composti organici riducibili e/o ossidabili.
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3 In voltammetria vengono utilizzati 3 elettrodi (riferimento, lavoro e controelettrodo) ed un potenziostato. Infatti, poichè E = i R, per controllare accuratamente E durante la scansione è necessario far avvenire le reazioni redox (passaggio di corrente) tra l elettrodo di lavoro ed un controelettrodo
4 Il segnale di corrente (i) è proporzionale alla concentrazione di analita solo quando dipende esclusivamente dalla diffusione dell analita alla superficie dell elettrodo. Processi di migrazione di carica vengono repressi con l uso di un elettrolita di supporto; quelli di convezione mediante controllo del trasporto di massa dell analita. δ = spessore dello strato di diffusione
5 A P Z Y X i l = corrente limite (o di diffusione)
6 Equazione dell onda i-v consideriamo la riduzione reversibile di una specie il cui prodotto è solubile sia nel mercurio che in soluzione oss + ne rid dall equazione di Nerst E = E 0 + RT/nF ln C 0 oss /C0 rid C 0 = concentrazione all interfaccia mercurio-soluzione vogliamo esprimere la concentrazione in funzione della corrente, quando viene raggiunto il potenziale a cui avviene la riduzione avremo una diminuzione di C 0 oss ed un aumento di C0 rid quindi: C 0 oss =C oss ki quando si raggiunge la corrente limite i l : C oss = ki l e C 0 rid = k i e C 0 oss = k (i l i) se poniamo K oss = 1/k e K rid = 1/k allora otteniamo l equazione dell onda: E = E 0 + RT/nF ln K rid /K oss + RT/nF ln (i l i)/i
7 per i = i l /2 (i l i)/i= 0 E 1/2 = E 0 + RT/nF ln K rid /K oss E 1/2 = potenziale di semionda il rapporto K rid /K oss è indipendente dalla concentrazione delle specie ed è uguale al rapporto tra i coefficienti di diffusione, se d rid /d oss 1 quindi E 1/2 E 0 e l equazione diventa: E = E 1/2 + RT/nF ln (i d -i)/i se in soluzione è presente anche la forma ridotta E sara funzione sia della corrente anodica che di quella catodica: E = E 1/2 + RT/nF ln [(i l ) c i] / [i (i l ) a ]
8 E 1/2 viene usato per analisi qualitativa e per il calcolo di costanti
9 1. la superficie si rinnova continuamente 2. lo strato di diffusione sulla superficie elettrodica è molto sottile 3. elevata sovratensione di idrogeno (campo catodico esteso) 4. campo anodico limitato (Hg e 2 Hg E 0 = )
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11 Intervallo di potenziale utilizzabile per diversi materiali elettrodici e diversi elettroliti di supporto
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13 In polarografia l O 2 deve essere eliminato dalla soluzione! L analisi polarografica quantitativa si basa sull equazione di Ilkovic: i d = KC = 607 n D 1/2 m 2/3 t 1/6 C n = numero di elettroni, D = coefficiente di diffusione della specie elettroattiva (cm 2 /sec)m = velocità di gocciolamento, t = tempo di gocciolamento, m 2/3 t 1/6 = costante del capillare, si determina sperimentalmente
14 Il picco voltammetrico si forma in soluzioni quiescenti in voltammetria con elettrodi solidi Ru(NH 3 ) 6 3+/2+ 1 mm in KCl O.1 M 50 KCl 0.1M i /µ A E E / mv E 1 t Elettrodo di carbone vetroso vs, SCE; velocità di scansione 50 mv/s Nella voltammetria ciclica il potenziale viene invertito ad un certo punto e viene effettuata una scansione in senso inverso. Viene utilizzata per studiare reazioni redox ha caratteristiche analitiche simili alla voltammetria lineare
15 La corrente misurata ad un elettrodo può essere divisa in due conponenti: la corrente capacitiva dovuta alla attrazione di cariche in soluzione da parte dell elettrodo carico (effetto condensatore) e la corrente faradica è dovuta allo scambio di elettroni. In pratica la corrente capacitiva rappresenta il rumore della misura voltammetrica. E 2 E 1 t elettrolita di supporto (KCl) Corrente capacitiva i t (ms) analita in elettrolita di supporto Corrente capacitiva + faradica
16 Voltammetria a scansione lineare quantità minima rilevabile 10-5 mol/l, separabilità tra picchi ~ 0.2 V. Voltammetria differenziale ad impulsi quantità minima rilevabile mol/l, separabilità tra picchi ~ 0.1 V. Voltammetria ad onda quadra quantità minima rilevabile mol/l, separabilità tra picchi ~ 0.1 V, tecnica estremamente rapida
17 In amperometria si applica un potenziale fisso all elettrodo (nella zona della corrente di diffusione) di lavoro e si misura la variazione di corrente in presenza dell analita. E necessario utilizzare delle strategie la selettività della misura. Nell elettrodo ad ossigeno di Clark si applica un potenziale di 0.7 V vs. Ag/AgCl ad un elettrodo di platino (od oro). La reazione all elettrodo di lavoro è O 2 + 4e + 4H + 2 H 2 O La selettività è garantita dalla membrana gas-permeabile (e.g. polipropilene) posta tra la cella elettrochimica e la soluzione campione.
18 2. M Hg M 2+ sol + 2e Tecniche di ridissoluzione elettrochimica Un analita in soluzione può essere estratto in un materiale elettrodico. Se la determinazione viene successivamente effettuata per via elettrochimica il metodo prende il nome di analisi elettrochimica per ridissoluzione Tali tecniche permettono di aumentare la sensibilità delle analisi polarografiche in quanto prevedono una stadio preliminare di arricchimento degli analiti sull elettrodo di lavoro. 1 stadio accumulo dell analita per elettrolisi o adsorbimento per intervalli di tempo definiti e a potenziali costanti 2 stadio ridissoluzione (stripping) dell analita in seguito a fenomeni ossidoriduttivi (p.es. scansione del potenziale in direzione anodica o catodica) con produzione di un segnale proporzionale alla concentrazione in soluzione La tecnica più utilizzata è la voltammetria di stripping anodico (ASV)per la rivelazione di metalli in tracce (limite di rivelabilità 10-9 /10-11 mol/l) 1. M 2+ sol + 2e M H
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20 Voltammetria di stripping catodico (CSV) formazione di uno strato insolubile di materiale sull elettrodo che viene ridotto per scansione catodica del potenziale 1 step 2Hg + 2X - Hg 2 X 2 + 2e 2 step Hg 2 X 2 + 2e 2Hg + 2X - utilizzata per anioni che formano sali insolubili con il mercurio, e sostanze organiche (p.es. contenenti zolfo) che formano composti insolubili con l Hg. In alcuni casi, p. es. CuSCN e Fe(OH) 3, l Hg non è coinvolto Voltammetria di stripping catodico adsorbitivo (ACSV) Lo stadio di arricchimento dell elettrodo è di tipo non elettrolitico (adsorbimento). La tecnica è particolarmente sensibile poiché l adsorbimento è solo superficiale e tutto il materiale adsorbito è immediatamente disponibile per la riduzione Ampio intervallo di applicabilità da sostanze organiche (composti aromatici, antibiotici, steroidi, etc.) a ioni inorganici mediante complessazione
21 METODI SPETTROSCOPICI Si basano sulla interazione e misura della radiazione elettromagnetica con l analita. Si possono dividere generalmente in metodi di assorbimento (attenuazione di un fascio di radiazione) e di emissione (radiazione emessa dall analita in particolari condizioni sperimentali) Più in dettaglio vengono classificati in base alla regione dello spettro elettromagnetico coinvolta
22 LE ONDE ELETTROMAGNETICHE Ampiezza (A) = lunghezza del vettore elettrico al massimo dell onda Lunghezza d onda (λ) = distanza tra i massimi (o i minimi) successivi Frequenza (ν) = numero di oscillazioni del campo elettrico al secondo (1 Hz = 1 ciclo al secondo) Velocità di propagazione (v) = νλ dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione
23 Nel vuoto la velocità di propagazione è massima (c cm/s). Nell aria la velocità e simile (0.03% in meno). Quando la radiazione attraversa un altro mezzo la velocità diminuisce a spese della lunghezza d onda, la frequenza è infatti invariata e dipende dalla sorgente di radiazioni. _ Numero d onda ( ν ) = numero di onde per cm 1/λ Potenza (P) = energia per unità di area al secondo. Correlata all ampiezza della radiazione La radiazione può essere trattata anche in forma particellare assimilandola a pacchetti discreti di energia (fotoni o quanti): E = hν h = costante di Planck = Js E = hc/ λ
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26 Assorbimento della radiazione
27 SPETTROFOTOMETRIA UV/visibile Quali elettroni danno luogo a transizioni misurabili nell UV/visibile? Gli elettroni in una molecola possono essere classificati in 4 tipi: elettroni non coinvolti in legami (E di eccitazione alte) elettroni di legami singoli covalenti (σ) (E troppo alte per UV/visibile) elettroni non leganti (tipo n) (E sufficienti per UV/visibile) elettroni in orbitali π (legami doppi e tripli) (E sufficienti per UV/visibile) Le transizioni avvengono in orbitali antileganti di tipo σ e π, le più comuni sono n π e π π. L intensità relativa delle bande di assorbimento è rappresentata dalle assorbività molari ε che sono una misura della probabilità che la transizione elettronica abbia luogo. La probabilità di transizioni π π è maggiore di transizioni n π
28 I gruppi che assorbono in una molecola sono chiamati cromofori. Le variazioni spettrali vengono classificate come batocromiche (massimo spostato verso λ maggiori) e ipsocromiche (verso λ minori). Variazioni d intensità vengono indicate come ipercromiche o ipocromiche.
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30 Trasmittanza (T) = P/P 0 T% = P/P Assorbanza = log P 0 /P = -log T Legge di Beer (vale per soluzioni diluite) : A = εbc ε = assorbività (o assorbanza specifica) molare b = cammino ottico c =concentrazione
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32 Additività delle assorbanze x λ1 A 1x(λ1) = ε x(λ1) b c x A 1y(λ1) = ε y(λ1) b c y A 2x(λ2) = ε x(λ2) bc x A 2y(λ2) = ε y(λ2) b c y
33 DEVIAZIONI DALLA LEGGE DI BEER chimiche. Le specie assorbenti danno reazioni di associazione, dissociazione o reazione con solvente con prodotti che hanno ε diversi (p.es. un indicatore acido-base in soluzione non tamponata) strumentali. Dovute a radiazioni spurie e al fatto che si usa radiazione policromatica per l assorbimento.
34 ERRORE SPETTROFOMETRICO
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37 MONOCROMATORI Servono a selezionare la lunghezza d onda desiderata, consistono di fenditure d ingresso e d uscita per eliminare le radiazioni indesiderate, un sistema di specchi per focalizzare la radiazione e un separatore di lunghezze d onda (prisma o reticolo)
38 Il prisma separa le varie componenti della luce perché l indice di rifrazione è diverso per ciascuna λ. La dispersione non è lineare (minore per λ maggiori). I reticoli presentano una supeficie riflettente piana di alluminio che presenta un numero grande di solchi paralleli. La separazione dipende dalla distanza tra i solchi. I reticoli producono anche multipli della radiazione incidente (ordini superiori). nλ = d (sen i + sen r) d = distanza tra le superfici, n ordine di diffrazione, i e r = radiazione incidente e riflettente La dispersione è lineare, vengono usati diversi tipi per l UV/visibile e l IR
39 L ampiezza di banda effettiva del monocromatore dipende oltre che dalle caratteristiche del reticolo anche dalla fenditura d uscita. Generalmente varia tra 1 e 20nm per applicazioni quantitative. Molti monocromatori hanno fenditure variabili che permettono di lavorare con rivelatori di diversa sensibilità I filtri sono caratterizzati da una λ alla quale si ha la massima trasmissione e da una ampiezza di banda. Quelli ad interferenza sono più selettivi (e più costosi). Quelli ad assorbimento sono costituiti da vetro colorato. Vengono utilizzati nel sistema ottico sia in presenza che in assenza di monocromatore (p.es. alcuni lettori per dosaggi immunochimici).
40 Contenitori per il campione (cuvette)
41 RIVELATORI PER SPETTROFOMETRI Sono di tipo fotonico (fino a λ = 2 µm); sono forniti di una superficie reattiva che in presenza di fotoni emette elettroni (fotoemissione) o li eccita in modo che possano condurre elettricità (fotoconduzione). I più comuni sono i fototubi, i fotomoltiplicatori e i rivelatori basati sulla tecnologia dei semiconduttori (a silicio)
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45 ASSORBIMENTO INFRAROSSO
46 Lo spettro è meno risolto a λ maggiori ( E tra i livelli energetici è minore)
47 Lo spettro può essere diviso in 4 zone: Zona di stretching dell idrogeno (λ = µm) Zona di stretching del triplo legame (λ = µm) Zona di stretching del doppio legame (λ = µm) Zona di stretching e bending del legame singolo (λ = µm)
48 La strumentazione è paragonabile a quella di uno spettrofotometro con l uso di materiali che non provochino interfererenze (p.es. cuvette di KBr). La sorgente è generalmente un solido riscaldato e in alcuni strumenti si usano rivelatori di calore (p.es. termocoppie) soprattutto utili nella regione a lunghezze d onda elevate. Alcuni strumenti più moderni (FTIR, spettrometro infrarosso a trasformata di Fourier) sono in grado di misurare contemporaneamente tutto lo spettro IR. La spettroscopia IR viene utilizzata molto spesso a scopo qualitativo. E uno strumento molto potente perché lo spettro IR della regione fingerprint (impronta digitale) a basse energie è praticamente unico per ogni molecole. Per l identificazione della molecola si confronta lo spettro ottenuto con quello di molti altri spettri disponibili in banche dati. Lo spettro deve essere registrato in opportune condizioni sperimentali (con la sostanza gassosa, solida o disciolta in un solvente che non interferisce).
49 SPETTROSCOPIA ATOMICA Può essere sia di emissione che di assorbimento. Il campione viene atomizzato prima della misura con varie fonti di energia termica. E utilizzata per circa 70 elementi.
50 SPETTRI ATOMICI L assorbimento o l emissione di energia da parte di un atomo può essere descritta nel modo più semplice con la teoria dei quanti (meccanica di Bohr) secondo cui le orbite in cui può trovarsi un elettrone sono quantizzate ed il momento angolare può differire solo di multipli interi del valore h/2π (h=costante di Planck) mvr = nh/2π n = numero quantico principale l energia associata alla transizione elettronica (assorbimento o emissione) è E = hν dove ν è la frequenza della radiazione spettrale ogni possibile transizione è pertanto associata ad una luminosa nello spettro di emissione e ad una oscura nello spettro di assorbimento
51 E è legata inversamente a n 2 per cui all aumentare di n E diminuisce (diminuisce la frequenza ed aumenta la lunghezza d onda). Se l energia fornita è sufficiente ad allontanare l elettrone si ha la formazione di uno ione positivo (potenziale di ionizzazione). L intensità di una riga spettrale è dipendente dalla probabilità del corrispondente salto elettronico, quindi saranno più intense le righe con una minore energia di eccitazione, la riga di risonanza (più basso livello eccitato) è quindi la più intensa. L atomo neutro ha proprietà diverse da quello ionizzato! p.es. 213,85 Zn I è la riga dell atomo neutro (per lo ionizzato si usa Zn II, Zn III e così via)
52 L insieme delle transizioni energetiche di un atomo di idrogeno può essere rappresentato in un diagramma di Grotrian che fornisce i valori dei livelli in scala proporzionale al numero d onda (numero di onde per unità di lunghezza)
53 Per atomi (e ioni) più complessi la situazione si complica perchè dobbiamo prendere in considerazione anche il contributo energetico dovuto agli altri numeri quantici dovuti al momento angolare dell elettrone (numero quantico l), allo spin (numero quantico s) e al momento magnetico (numero quantico m)
54 se si usano spettroscopi ad alto potere risolutivo si osserva che molte righe spettrali dei metalli alcalini sono doppie, p.es. la riga gialla del sodio è in realtà costituita da 2 righe a 589,0 e a 589,6 nm a causa dell effetto del momento angolare di spin (s), la riga a 589,0 è 2 volte più intensa di quella a 589,6 a causa del numero quantico magnetico (m) spettroscopia di emissione sorgente di eccitazione fiamma rivelatore sistema fotoelettrico FOTOMETRIA DI FIAMMA strumentazione simile a quella spettrofotometrica ma il campione viene nebulizzato in una fiamma sotto forma di soluzione la radiazione emessa viene risolta da un sistema ottico opportuno e l intensità della riga prescelta misurata con il rivelatore
55 secondo il tipo di fiamma usata si possono eccitare vari atomi ad energia di eccitazione diversa (a C i metalli alcalini, a 3000 C circa 50 elementi diversi)
56 la fotometria di fiamma è molto utilizzata per gli elementi del I e II gruppo del sistema periodico. p.es. il limite di rivelabilità per il sodio può essere fino a 0.2 µg/l con precisione dello 0.5% a causa delle temperature relativamente basse si ottengono degli spettri poveri di righe, per la misura del sodio (doppietto a 589 nm) e del potassio (doppietto a 768 nm) è sufficiente un filtro per isolare la radiazione desiderata, per gli altri elementi è necessario utilizzare un monocromatore
57 Interferenze: gli spettri di righe sono sovrapposti allo spettro continuo dovuto alla fiamma stessa, quindi si deve effettuare un bianco in assenza di analita il tipo di solvente organico utilizzato influenza la viscosità del campione e quindi la velocità alla quale viene bruciato. Inoltre i solventi organici alterano la temperatura della fiamma favorendo l emissione ed aumentando la sensibilità L energia termica della fiamma può essere sufficiente a ionizzare alcuni elementi ciò influenza la curva di calibrazione dell elemento. Per eliminare il problema si usano dei tamponi spettroscopici (p.es. il cesio) a bassa energia di ionizzazione
58 ad alte concentrazioni di analita si ha invece autoassorbimento della radiazione per collisione con atomi della stessa specie allo stato fondamentale
59 Analisi quantitativa: interpolazione di rette di calibrazione ottenute da soluzioni standard nel solvente o nella matrice di misura uso di uno standard interno (p.es litio; 671 nm) nelle ordinate della retta di calibrazione si riporta il rapporto tra le 2 righe Il metodo delle aggiunte, elimina qualsiasi interferenza dovuta alla composizione del campione, gli standards vengono aggiunti al campione. La concentrazione viene determinata dal valore relativo all intersezione della retta ottenuta con l asse delle ascisse
60 ASSORBIMENTO ATOMICO E molto importante sia nella spettroscopia di emissione sia in quella di assorbimento conoscere il n di atomi che si trovano allo stato fondamentale (p.es. in una fiamma) gli elettroni sono statisticamente distribuiti tra i vari livelli energetici secondo l espressione di Maxwell-Boltzmann N u /N 0 =g u /g 0 e -(E u E 0 ) / kt N u = stato eccitato, N 0 = stato fondamentale, g u e g 0 = pesi statistici dei livelli (probabilità che un elettrone rimanga ad un dato livello energetico), E = energia del livello, k = costante di Boltzmann
61 nella fotometria di fiamma si misura una proprietà degli atomi allo stato eccitato, nell assorbimento atomico una proprietà degli atomi allo stato fondamentale, quindi, vista la popolazione relativa di atomi, per la maggior parte degli elementi sarà più sensibile l assorbimento atomico piuttosto che l emissione (in fiamma!) I metalli alcalini si possono misurare con buona sensibilità perché il limite di rilevabilità dipende dal rumore del rivelatore (fotomoltiplicatore) e della fiamma, il segnale va da zero ad una quantità finita. In assorbimento si misura la differenza di 2 segnali con rumore molto simile ed il limite di rilevabilità dipende dal rumore di entrambi. la sorgente (di righe) più comune nell A.A. è la lampada a catodo cavo.
62 Il catodo è fabbricato con l elemento che si vuole determinare (o una lega), l anodo è di tungsteno. Viene riempita a bassa pressione con argon o neon e si applica un potenziale tale da generare una corrente costante tra 1 e 50 ma. Il gas viene ionizzato all anodo e accelerato verso il catodo provocando l emissione di atomi metallici eccitati che emettono lo spettro del materiale catodico.
63 L uso di una sorgente di righe in A.A. permette una maggiore sensibilità e linearità di risposta all analita, con strumentazione meno complessa e costosa. Infatti, utilizzando una sorgente continua ed un ottimo monocromatore (banda passante di 0.01 nm, λ max = nm) il rumore di fondo sarebbe in ogni caso talmente ampio da non poter essere discriminato con i fotomoltiplicatori tradizionali.
64 La sensibilità è definita come la concentrazione che dà un assorbimento dell 1% (assorbanza ), è una misura del segnale assoluto previsto per un dato insieme di condizioni sperimentali ma non dà informazioni riguardo al rumore. Il limite di rivelazione (o rivelabilità) è definito come la concentrazione relativa a due volte la deviazione standard del rumore di fondo (s/n = 2)
65 maggiore sensibilità per l atmosfera inerte in cui viene atomizzato il campione, il mezzo altamente riducente (carbonio ad elevate t) e la scarsa emissione di fondo. La t max e dello stesso ordine di grandezza della fiamma. Si può lavorare con quantità minime di campione (0.1 mg). Si procede prima all eliminazione del solvente (100 C), poi all incenerimento (t secondo la matrice) ed in ultima fase all atomizzazione.
66 Interferenze spettrali l interferenza di riga spettrale è rara nell A.A., sono più diffuse quelle di assorbimento molecolare (p.es. il CaOH interferisce sulla riga a nm del Ba) se non c è vaporizzazione completa del campione la radiazione può essere diffusa Interferenze chimiche si hanno per formazione di composti refrattari nella fiamma (p.es. pirofosfato di Ca, oppure ossidi) per reazioni con anioni presenti nel solvente. Si eliminano con l aggiunta di opportuni reagenti al campione (p.es, cloruri di Sr e di La, o EDTA per il Ca) che vengono aggiunti anche agli standard. Altro metodo è di utilizzare una fiamma a t maggiore.
67 SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE A PLASMA Il plasma viene definito come un gas elettricamente neutro in uno stato di elevata ionizzazione e quindi composto di atomi, molecole, ioni ed elettroni liberi. Si può indurre in un flusso di argo con un forte campo elettrico (DCP, Direct Current Plasma) o un forte campo a radiofrequenza (ICP, Inductively, Coupled Plasma). Le temperature raggiunte sono tra i 7000 e C.
68 la temperatura di equilibrio del plasma varia in funzione dell altezza della torcia, da cui dipenderà l intensità di emissione il campione viene prima nebulizzato e poi trasportato nel plasma mediante pompa peristaltica a flussi di ml al minuto si producono spettri ricchi di righe (pochi atomi allo stato fondamentale) e quindi bisogna discriminare la radiazione emessa con i monocromatori, per questo motivo le interferenze spettrali sono più frequenti nell ICP la corrente ad alta frequenza (27 MHz) genera un campo magnetico oscillante che produce attraverso gli atomi del gas inerte un flusso di elettroni e di ioni
69 campo di applicabilità ampio, curve di taratura con linearità fino a 5 ordini di grandezza (p.es. da 0.01 a 1000 mg/l per il Fe). Limiti di rivelabilità paragonabili all A.A.
70 rispetto all A.A. ha il vantaggio che è possibile fare delle analisi multielemento in sequenza o utilizzando una serie di rivelatori posizionati opportunamente
71 SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE E una spettroscopia di emissione, le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazione elettromagnetica, emettono radiazione. Il processo avviene in tempi rapidi (meno di 10-5 s). La sensibilità della spettroscopia di fluorescenza è maggiore rispetto alla spettrofotometria (da 1 a 3 ordini di grandezza). L applicabilità è limitata a molecole che sono in grado di fluorescere.
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73 Lo spettro di fluorescenza è una immagine speculare di quello di assorbimento a λ maggiori (spostamento di Stokes). Le linee che si sovrappongono vengono dette di risonanza.
74 Quali molecole emettono fluorescenza? Solo quelle in cui il rilassamento non radiativo ha velocità paragonabili a quelle del processo fluorescente Il rendimento quantico Φ rappresenta il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti (o n di molecole che emettono su n che assorbono) I composti fluorescenti sono generalmente composti aromatici, Φ aumenta con il numero di anelli ed il grado di condensazione
75 Una sostituzione sull anello aromatico provoca non solo una variazione delle λ di assorbimento ed emissione ma anche una variazione di Φ. La rigidità della molecola influenza significativamente Φ. Molecole più rigide emettono con efficienza maggiore. La fluorescenza diminuisce all aumentare della temperatura per effetto delle collisioni molecolari.
76 L intensità di fluorescenza è direttamente proporziona al potere radiante P 0 della radiazione incidente per P 0 costante F = Kc F = K (P 0 P) La proporzionalità diretta viene persa per valori di assorbanza maggiori di 0.05 (90% di trasmittanza) a causa dell autospegnimento (self-quenching).
77 (SPETTRO)FLUORIMETRI Sono a doppio raggio per compensare variazioni di potere radiante; il rivelatore è a 90 rispetto alla cuvetta
78 I metodi in fluorescenza sono più sensibili rispetto a quelli spettrofotometrici perché aumentando la P 0 della sorgente o la sensibilità del rivelatore si possono misurare quantità più piccole (in assorbanza no!). I metodi possono essere diretti o indiretti. Questi ultimi basati sullo spegnimento (quenching) di fluorescenza dopo reazione con l analita. Nei rivelatori fluorimetrici per cromatografia si derivatizza il campione prima della separazione
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