Un agente di contrasto accelera il rilassamento dei protoni dell acqua. del tessuto in esame. Si usano sostanze paramagnetiche.

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1 Un agente di contrasto accelera il rilassamento dei protoni dell acqua del tessuto in esame. Si usano sostanze paramagnetiche. Lo ione metallico più usato è Gd(III) : - sette elettroni spaiati - rilassamento elettronico lento.

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3 Nome chimico Nome Commerciale Compagnia [Gd(DTPA)(H 2 O)] 2- Magnevist Schering (Germania) [Gd(DOTA)(H 2 O)] - Dotarem Guerbet (Francia). [Gd(DTPA-BMA)(H 2 O)] Omniscan Nycomed-Amersham (U.K.) [Gd(HPDO3A)(H 2 O)] ProHance Bracco (Italia) [Gd(BOPTA)(H 2 O)] 2- MultiHance Bracco (Italia) [Gd(EOB-DTPA)(H 2 O)] 2- Eovist Schering (Germania)

4 Ci sono due meccanismi attraverso i quali avviene il rilassamento per agenti paramagnetici: 1) Rilassamento di SFERA INTERNA; una molecola di acqua e legata nella sfera di coordinazione interna allo ione paramagnetico e scambia rapidamente con il solvente. 2) Rilassamento di SFERA ESTERNA; dovuto a molecole di acqua che diffondono nella sfera di coordinazione esterna dello ione paramagnetico. Per i fattori di contrasto superparamagnetici l unico meccanismo è quello di sfera esterna.

5 Un complesso di Gd(III) induce aumenti di entrambe le velocità di rilassamento (1/T 1 e 1/T 2 ). 1 = T i obs T id T ip i=1,2 1 1 = T i obs T id + r i [Gd] con r i = RELASSIVITA

6 La relassività dei protoni è indice diretto dell efficienza di una sostanza paramagnetica nell aumentare la velocità di rilassamento dei protoni dell acqua e perciò della sua efficienza come agente di contrasto. Il rilassamento si origina dalle interazioni dipolo-dipolo tra gli spin nucleari e il campo magnetico locale generato dagli elettroni spaiati. Quindi poiché il campo magnetico diminuisce rapidamente con la distanza, sono molto importanti le interazioni chimiche che tengono i protoni delle molecole di acqua nelle immediate vicinanze dello ione metallico.

7 - RILASSAMENTO DI SFERA INTERNA - RILASSAMENTO DI SFERA ESTERNA 1 1 int 1 = + T ip T ip T ip est i=1,2 r i = r i int + r i est

8 Dinamica molecolare di [Gd(DOTA)(H 2 O)] - in soluzione acquosa Rilassamento di seconda sfera

9 RILASSAMENTO DI SFERA INTERNA 1 Cq 1 = T T 1m +τ m c = concentrazione molare del complesso paramagnetico q = numero di molecole di acqua legate al Gd (numero di idratazione) 1/T 1m = velocità di rilassamento longitudinale delle molecole di acqua legate al Gd τ m = tempo di vita delle molecole di acqua nella sfera interna (1/k ex )

10 RILASSAMENTO DI SFERA INTERNA 1 Cq 1 = T τ m T -2 2m + τ -1 m T -1 2m + ω (τ -1 m + T -1 2m ) 2 + ω ω m 2 ω m 2 dove 1/T 2m è la velocità di rilassamento trasversale delle molecole di acqua legate, ω m è la differenza di chemical shift tra il complesso paramagnetico e uno diamagnetico preso come riferimento. La relassività è influenzata da numerosi parametri: B τ m T 1e T 2e τ R q r GdH

11 L influenza di q e di r GdH è facile da comprendere: 1 C q 1 T 1 = 55.5 T 1m 1 T 1 1 r 6 GdH - raddoppiando q (2 molecole di acqua nella sfera interna) raddoppia 1/T 1. - una distanza Gd-H lievemente più lunga darà una significativa diminuzione di 1/T 1. Più complicato è predire l influenza degli altri parametri considerando che essi dipendono anche dalla forza del campo magnetico.

12 Influenza dei vari parametri sulla relassività di sfera interna. Relassività di sfera interna calcolata in funzione di τ m e τ R per vari valori di T 1e a 0.5 T (~ 21 MHz) e 1.5 T (~ 64.5 MHz), q=1 e r GdH = 3.1 Å.

13 [Gd(DOTA)H 2 O] - HOOC COOH N N N N HOOC COOH [Gd(HPDO3A)H 2 O] HOOC N N CH 3 OH HOOC N N COOH

14 Impossibile visualizzare l'immagine. Impossibile visualizzare l'immagine. Impossibile visualizzare l'immagine. Fattori di contrasto. [Gd(DTPA)H 2 O] 2- COOH HOOC N N N COOH HOOC HOOC O [Gd(BOPTA)H 2 O] 2-

15 Distanza Gd-H 1 1 T 1 r 6 GdH Un rapido calcolo mostra che una diminuzione di 0.1 Å nella distanza tra Gd-H corrisponde ad un aumento della relassività del 20%, mentre una diminuzione di 0.2 Å porta una aumento di circa il 50%. Nonostante la loro grande importanza, i valori di r Gd-H sono difficili da ottenere sperimentalmente, e i valori ottenuti sono generalmente delle stime.

16 Il design di un mezzo di contrasto di Gd 3+ deve ovviamente tendere a dare un sistema ad alta relassività tenendo sotto controllo gli altri fattori associati alla stabilità, alla solubilità, alla farmacocinetica ecc. La valutazione del ruolo dei diversi parametri viene normalmente perseguita attraverso la misura della relassività in funzione della frequenza di osservazione. Alle frequenze più comunemente utilizzate nei tomografi MRI la velocità di rilassamento è determinata dal valore di τ R, per cui sistemi a massa molecolare elevata forniscono le prestazioni migliori.

17 Impossibile visualizzare l'immagine. Fattori di contrasto. Per complessi di Gd(III) a basso peso molecolare la veloce rotazione è il fattore limitante per la relassività ai campi magnetici usati in MRI.

18 τ R = 4πη πηr 3 eff/3kt r eff non è conosciuto esattamente e η (microviscosità) può essere considerevolmente diversa dalla macroviscosità della soluzione. Tuttavia si possono confrontare i tempi di correlazione rotazionale di sistemi simili ma con diverso peso molecolare. In questi casi si può supporre che la microviscosità dei due sistemi sia la stessa e che il rapporto tra i valori di r 3 eff si possa esprimere come rapporto tra i pesi molecolari.

19 τ R è ottenuto da misure di tempi di rilassamento longitudinali di 17 O o di 1 H. I valori ottenuti attraverso i due metodi sono diversi. Questa discrepanza può essere in parte spiegata considerando che la distanza usata nei due casi è diversa: r Gd-O(acqua) e r Gd- H(acqua). I valori di τ R aumentano con l aumento del peso molecolare. Tuttavia questo aumento non è lineare come invece previsto dalla formula di Debye. La ragione di ciò risiede nella flessibilità della molecola. Poiché le molecole non sono completamente rigide i movimenti dei vettori possono essere più veloci di quelli dell intera molecola.

20 τ R (10-12 s) metodo P.Mol. DTPA O 563 DOTA O 575 DTPA-BMA O 587 dendrimeri O 20000/60000

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22 I parametri che descrivono la velocità di scambio dell acqua sono poco influenzati dalla struttura micellare Complessi di Gd(III) legati non covalentemente ad una proteina

23 r i = r i int + r i est r i = r i int + r i est + r i 2nd r i 2nd = P m Somm 1 T 1j + τ mj P m = frazione molare dei nuclei delle molecole di acqua legate τ mj è il tempo di vita di una molecola di acqua (j) del secondo shell (M sono tutte le molecole del secondo shell) T 1j si può stimare con equazioni simili a sfera interna

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25 Il contributo di sfera interna a campi alti è controllato principalmente da τ R per cui dipende dalle dimensioni. A campi bassi il fattore dominante è T 1e che dipende anche dalla simmetria del complesso e dalla natura dei gruppi coordinanti. τ s0 (tempo di rilassamento elettronico a campo zero) [Gd(DOTA)] ps [Gd(DTPA)] 2-72 ps

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27 Per aumentare la velocità di rilassamento aumentare τ R aumentando il peso molecolare ma anche la rigidità aumentare velocità di scambio dell acqua aumentare q

28 I complessi metallici usati come agenti di contrasto sono somministrati per via endovenosa. dose tipica mmol/kg di peso corporeo totale - OOC N N COO - PM = OOC N Gd 3+ N Meg COO gr. per una persona di 80 Kg Meg = N-metilglucammina OH OH OH OH OH N H 2 + CH 3

29 Legante osmolarità misurata in soluzione di GdL a 37 C DTPA 1.96 DTPA-BMA 0.65 BOPTA 1.97 DOTA 1.35 HPDO3A 0.63 Plasma osmolarità dei complessi carichi molto elevata - i complessi neutri (rosso) presentano un osmolarità più vicina a quella del plasma e sono preferiti per alti dosaggi

30 Composto LD 50 animale mmol kg -1 GdCl topo 0.4 cavia Gd(OH) cavia (Meg) 3 H 2 DTPA 0.15 cavia Na 2 H 3 DTPA 0.1 cavia (Meg) 2 H 2 DOTA 0.18 cavia Meg[Gd(EDTA)] 0.3 topo (Meg) 2 [Gd(DTPA)] 6-10 topo Na 2 [Gd(DTPA)] 5.6 topo >10 cavia Meg[Gd(DOTA)] 11 cavia Na[Gd(DOTA)] >10 cavia [Gd(HP-DO3A)] 12 cavia (Meg) 2 [Gd(BOPTA)] 5.8 cavia

31 Costanti di stabilità - M+ L = ML - costanti di protonazione di L - M può essere complessato da fosfato, bicarbonato, citrato - L può formare complessi con metalli endogeni (Mg, Ca, Zn, Cu) GdL H + specie protonate del complesso L complessi ternari

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33 Con simulazioni al calcolatore si è determinato la percentuale di Gd 3+ presente come complesso a ph fisiologico (ph=7.4): 93.9% HPDO3A 93.8% DOTA 93.4% HPDO3A-3HM 89.1% DO3A-3HM 87.8% DO3A 84.8% DTMA Lo ione Gd rilasciato è precipitato sotto forma di GdPO 4 e il legante libero forma complessi con Cu 2+, Zn 2+ e Ca 2+. Le proprietà termodinamiche (stabilità dei complessi e basicità dei leganti) giocano un ruolo importante nel valutare l applicabilità di un legante come agente di contrasto.

34 Agenti di contrasto AGENTI INTERRUTTORE Sono specie chimiche che funzionano come agenti di contrasto in un certo stato (acceso) e non funzionano da agenti in un altro stato (spento): a) Agenti di contrasto attivati enzimaticamente

35 Agenti di contrasto Un derivato del DTPA che contiene un gruppo solfonammide che si lega selettivamente all enzima anidrasi carbonica. Quando il complesso di Gd è legato all enzima la relassività aumenta significativamente (circa 5 volte a 40 MHz) dovuto ad una aumento di τr.

36 Agenti di contrasto b) Agenti di contrasto per la determinazione di molecole di importanza biologica - Il ferro è un elemento chiave in campo biologico e in molti enzimi, perciò la sintesi di un agente di contrasto sensibile allo ione ferro è molto importante.

37 Agenti di contrasto triscomplesso Gd(phen)HDO3A Il legante (phen)hdo3a è costituita da una parte macrociclica che lega fortemente gli ioni lantanidi e da una unità fenantrolinica che è un buon agente complessante per lo ione Fe(II). Gd(phen)HDO3A si associa spontaneamente in presenza di Fe(II) per formare un tris complesso con alto peso molecolare. A 20 MHz, forza di campo usata in medical imaging, la relassività varia da 5.1 a 12.5 mm-1s-1.

38 Agenti di contrasto - Un altro esempio sono gli agenti di contrasto sensibili allo ione Ca2+. Lo ione Ca(II) è un importante messaggero intracellulare della traduzione del segnale. Cambiamenti della sua concentrazione provocano cambiamenti del metabolismo cellulare e sono responsabili della segnalazione e regolazione cellulare. E quindi importante avere segnalazioni sulla sua concentrazione nelle cellule. E stato sintetizzato un legante (DOPTA) il cui complesso di gadolinio presenta una relassività modulata selettivamente dalla concentrazione di Ca 2+ (la relassività aumenta dell 80% quando è aggiunto Ca 2+ ). Questa variazione è dovuta alla presenza di due conformazioni in assenza e in presenza di calcio(ii).

39 Agenti di contrasto Una applicazione immediata di questo agente di contrasto è lo studio delle variazioni nell attività cellulare del Ca(II) durante l embriogenesi. L agente puo essere convenientemente iniettato nella cellula in uno stato iniziale di sviluppo e quindi monitorare il movimento cellulare e le fluttuazioni dello ione calcio durante lo sviluppo. Questo puo essere utile quando non è possibile investigare livelli cellulari interni che non sono accessibili alla luce e quindi non possono essere studiati con tecniche di microscopia ottica.

40 Agenti di contrasto - Anche lo Zn(II) è uno ione che gioca un ruolo chiave in molti processi, è stato quindi sintetizzato un legante consistente in Gd-DTPA modificato. L L1

41 Agenti di contrasto Il legante L1 con un braccio amminoetilestere mostra una relassività che non varia con la concentrazione di Zn 2+. Invece per il legante L la relassività ha un andamento particolare e cioè diminuisce con rapporti molari di Zn compresi tra 0 e 1, raggiunge un minimo ad 1, poi riaumenta tra 1 e 2. L1 L

42 Agenti di contrasto relassività (mm -1 s -1 ) di GdL con aggiunte di Zn 2+, Ca 2+ e Mg 2+ no addizione Zn 2+ Ca 2+ Mg

43 Agenti di contrasto c) Agenti sensibili al ph Il ph di alcune cellule tumorali è più basso di quello delle cellule sane. Poiché il ph è un importante indicatore fisiologico molti ricercatori si sono impegnati nel creare agenti di contrasto sensibili al ph. L: R=C 4 H 9 GdL1 L1: R=C 8 H 17 GdL

44 Nanoparticelle Nanoparticella: particella di forma pressoché sferica e di diametro minore di 1µm. Alcuni utilizzi delle nanoparticelle MAGNETICHE in campo biomedico: trasporto di farmaci a specifiche zone dell organismo (immissione di informazioni) diagnosi ultrasensibili grazie al miglioramento della qualità delle immagini ottenute per MRI (estrazione di informazioni) terapia genica rapida eliminazione di sostanze tossiche dall organismo trattamento ipertermico di cellule tumorali rivelazione di virus e batteri in bassissime concentrazioni - particelle superparamagnetiche: costituite da nuclei di ossido di ferro - particelle ferromagnetiche: costituite da metalli di transizione come Fe, Co, Ni

45 Nanoparticelle Le principali sfide nella sintesi di nanoparticelle magnetiche sono: ridurre le dimensioni garantire stabilità a ph fisiologico funzionalizzare la superficie Destino delle nanoparticelle nell organismo:

46 Agenti superparamagnetici Sono ossidi di ferro (Fe 3 O 4 ) dove è presente una cooperatività in cui ogni individuale spin S dà luogo ad un SUPERSPIN S=NS con N numero di ioni paramagnetici presenti nella molecola. Una particella è costituita da un nucleo di uno o più cristalli magnetici (grani) incastrati in un rivestimento (destrano, albumina, amido) il quale previene l agglomerazione. Dimensioni cristallo > 50nm SPIO small particles of iron oxide Dimensioni cristallo < 50nm USPIO ultra small particles of iron oxide

47 Agenti superparamagnetici La relassività e il comportamento biologico di un colloide superparamagnetico dipende dalle dimensioni dei cristalli, dalla composizione chimica, dal tipo di rivestimento. I momenti magnetici dei singoli ioni ferro che costituiscono le particelle SPIO e USPIO non si controbilanciano, perciò in un campo magnetico il momento magnetico totale permanente è molto grande. SPIO essenzialmente accumulate nel fegato (60-80%) e nella milza. Vengono eliminate velocemente.agiscono su T 2. USPIO agiscono sul T 1 si diffondono negli spazi intracellulari, permanenza più lunga. Dosi 6-23 mg di Fe per Kg di peso corporeo.