glicomica) è un ambito di ricerca che si è

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1 La glicobiologia (cui si è associata la glicomica) è un ambito di ricerca che si è sviluppato recentemente! I carboidrati svolgono in vivo molteplici funzioni. Oltre alle normali funzioni strutturali (es. cellulosa) e di immagazzinamento di energia chimica (es. amido, amilosio, glucosio, ecc.), i carboidrati sono responsabili della comunicazione inter-cellulare e svolgono un ruolo cruciale nel riconoscimento cellulare!

2 Rappresentazione schematica di una membrana cellulare, con glicoproteine, glicolipidi e proteine legate a glicosilfosfatidilinositolo (GPI)

3 Monosaccaridi in forma aldeidica aperta ed in forma ciclica

4 Alcuni aldoesosi molto comuni

5 Alcuni disaccaridi molto comuni

6 Le cellulose e gli amidi

7 Molti metaboliti secondari hanno struttura saccaridica. La digitossina è un glicoside cardioattivo isolato da Digitalis Purpurea.

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9 Molti amminoglicosidi hanno attività antibiotica: la streptomicina (antibiotico a largo spettro) è stato il primo derivato attivo scoperto

10 Altri esempi rappresentativi di amminoglicosidi dotati di attività antibiotica L emergere di ceppi batterici resistenti agli antibiotici più utilizzati (neomicina, vancomicina) ha reso urgente la necessità di una nuova generazione di antibiotici con maggiore attività

11 3) Interazione con RNA batterico. Antibiotici a struttura amminoglicosidica Meccanismi d azione più comuni: 1) Riconoscimento da parte delle Selectine (proteine di membrana); 2) Inibizione delle glicosidasi o glicosiltransferasi;

12 Struttura dell RNA 16S ribosomiale batterico e siti di legame degli antibiotici amminoglicosidici

13 Sintesi di oligosaccaridi: ovvero, come formare un legame glicosidico Da un punto di vista teorico, la sintesi di oligosaccaridi pone molti più problemi rispetto alla sintesi peptidica o alla sintesi di oligonucleotidi: I monosaccaridi sono building block multifunzionali. I diversi gruppi OH devono essere adeguatamente protetti; Gli oligomeri da sintetizzare possono essere anche polimeri non lineari; le ramificazioni richiedono un elevato controllo della regiochimica e quindi uno schema complesso di gruppi protettori ortogonali; Le rese delle reazioni dipendono notevolmente dalla natura dei due partner da accoppiare e raramente sono quantitative; La formazione del legame richiede un forte controllo stereochimico per far sì che si formi solo l anomero α o β desiderato (di difficile separazione!); La sintesi dei building block monosaccaridici opportunamente protetti ed attivati è di per sé complessa!

14 Formazione del legame glicosidico per via enzimatica (principali vantaggi: efficienza e selettività del processo, che non richiede inoltre uso di protezioni per gli altri gruppi funzionali)

15 Formazione del legame glicosidico per via chimica Una reazione di glicosilazione avviene fra: un glicosil donatore (zucchero reattivo al C-1) e un glicosil accettore (zucchero avente un ossidrile o altra funzione nucleofila disponibile). L attivazione richiede un opportuno agente attivante (promotore); perché la reazione sia regio-specifica, è necessario proteggere gli altri gruppi funzionali non implicati nella formazione del legame.

16 Sintesi schematica di un disaccaride: accoppiamento fra un glicosil-donatore ed un glicosil-accettore

17 Ordine generale di reattività del glicosil-accettore per il glucopiranosio 6-OH >> 3-OH > 2-OH > 4-OH Questo ordine di reattività generale è comunque modulato da: scelta dei gruppi protettori (effetti sterici ed effetti elettronici dei sostituenti) modifiche della struttura (ad es., formazione di strutture 1,6-anidro, ecc.)

18 Metodo Koenigs-Knorr per la sintesi di oligosaccaridi Metodo classico: si basa sull uso di un glicosil alogenuro, come donatore, e di sali di metalli pesanti come promotori. VANTAGGI: 1) La reattività del glicosil donatore può essere modulata in base alla natura dell alogeno e del promotore, nonché dalla scelta dei gruppi protettori; 2) La diastereoselettività della reazione è assicurata da: a) partecipazione dei gruppi vicinali per la β-glicosidazione di D- glucosio, D-glucosammina, D-galattosio e D-galattosammina e a-glicosidazione di D-mannosio, L-fucosio e L-ramnosio; b) anomerizzazione in situ dell α- al β-glicosil alogenuro, che reagisce a dare α-glicosidi nel caso di D-glucosio, D- glucosammina, D-galattosio e D-galattosammina.

19 La reazione di glicosidazione è soggetta a stringenti requisiti di regio- e stereoselettività. Il primo requisito richiede la selezione degli opportuni gruppi protettori da adoperare per derivatizzare tutte le funzioni ossidriliche presenti sul glicosil accettore a meno di una, che va lasciata libera perché operi l attacco nucleofilo alla posizione anomerica del glicosil donatore. Quindi i gruppi da impiegare devono possedere precise caratteristiche: devono poter essere facilmente installabili ed altrettanto facilmente rimuovibili selettivamente. Inoltre il processo di rimozione deve potersi eseguire in condizioni chimiche compatibili con la stabilità del legame glicosidico. Al fine, inoltre, di realizzare la necessaria stereoselettività bisogna considerare che è possibile indirizzare l attacco del nucleofilo alla posizione anomerica mediante una opportuna scelta del gruppo protettore installato sulla funzione ossidrilica in 2 del glicosil donatore. Infatti gruppi protettori acilici portano alla formazione di un intermedio ciclico di tipo diossonio dal quale poi si genera un prodotto di tipo 1,2-trans.

20 Metodo Koenigs-Knorr per la sintesi di oligosaccaridi SVANTAGGI: 1) I glicosil alogenuri sono termicamente instabili: devono essere preparati in situ e maneggiati a basse T ed inoltre 2) sono molto sensibili all idrolisi; 3) i sali dei metalli pesanti sono costosi ed inoltre 4) sono tossici (sali di Hg) o esplosivi (AgClO 4 ), comunque difficili da maneggiare su larga scala.

21 Tipi di glicosil donatori utilizzabili:

22 Ruolo dei gruppi protettori I gruppi protettori presenti sul glicosil donatore interferiscono con la sintesi del legame glicosidico non solo attraverso la cosiddetta partecipazione del gruppo vicinale, ma anche attraverso specifici effetti elettronici. Si distinguono glicosil donatori disarmati e armati ; i primi presentano gruppi protettori elettronattrattori, che sottraggono densità elettronica al C-1 (acetili, benzoili, pivaloili, ecc.) e quindi rendono la reazione più lenta; i secondi presentano gruppi non elettron attrattori (benzile, ecc.), che risultano più reattivi.

23 Un glicosildonatore oggi molto usato: il derivato tricloroacetimmidato

24 Sintesi di zuccheri 1-tricloroacetimmidati: anomero α e anomero β

25 Formazione del glicoside tricloroacetimmidato: a) processo sotto controllo termodinamico (β); b) processo sotto controllo cinetico (α). Le stabilità dei due anomeri sono paragonabili; gli O-glicosil tricloroacetimmidati possono essere cristallizzati e conservati a lungo a +5 C senza particolari precauzioni.

26 Uso di tricloroacetimmidati nella sintesi di oligosaccaridi Acidi di Lewis più usati nella reazione di glicosilazione: trimetilsililtriflato, BF 3. Et 2 O, triflato di stagno, triflato di argento, ZnCl 2. Et 2 O.

27 Un tipico sottoprodotto della reazione è l 1,2-ortoestere

28 Sintetizzatore automatico di oligosaccaridi Prototipo sviluppato da Peter H.Seeberger nel 2001, ottenuto mediante modifiche di un sintetizzatore automatico di peptidi.

29 Sintesi automatizzata del nonasaccaride, completamente protetto, Lewis x -Lewis y : schema retrosintetico basato su 5 differenti building block (2-6)

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31 Esempi di farmaci a struttura saccaridica presenti sul mercato e loro azione

32 Vaccini in sperimentazione a struttura saccaridica a) contro la malaria; b) contro la Leishmaniosi

33 Antigeni a struttura saccaridica in sperimentazione come vaccini antitumorali

34 Concetto di multivalenza: per aumentare le deboli interazioni di binding del ligando nei confronti del recettore, si tende a massimizzare l energetica di legame esponendo un numero ampio di ligandi

35 Uso di carboidrati in diagnostica: 1) micro-array di carboidrati (glico-arrays) Peculiarità nella sintesi: non è affidabile una on-bead synthesis; la preparazione dell array può avvenire per a) adsorbimento del glicoconiugato sul supporto in questo caso, polistirene o altra matrice idrofobica; b) legame covalente dell oligosaccaride già assemblato alla matrice. Problemi spaziali nei glico-array! Effetto del superaffollamento di ligandi sulla superficie di una matrice

36 Uso di carboidrati in diagnostica: 2) polimeri fluorescenti funzionalizzati con carboidrati Rivelazione di batteri mediante polimeri fluorescenti: a) mutante di E.coli che non lega il polimero; b) forme aggregate di batteri fluorescenti; c) immagine di fluorescenza di un ampio cluster batterico fluorescente

37 Diversità molecolare accessibile per 3 sostituenti (A, B e C) presenti su una struttura piranosidica

38 Building block del D-glucosio e dell acido 2-amminoglucuronico ortogonalmente protetti ( consentono l introduzione di 3 e 4 farmacofori diversi, R, sullo scaffold centrale)

39 Esempi di diversificazione on-resin impiegando building block ortogonalmente protetti

40 Molti esempi di glicopeptidi e glicoproteine sono rinvenuti in natura. La glicosilazione di un peptide può essere una utile modifica per ottenere protezione contro le proteasi ed incremento della solubilità in acqua Glicopeptide MEN 11420, sviluppato dalla Menarini: mostra maggiore potenza in vivo e durata rispetto al ciclopeptide non glicosilato

41 Esempi di peptidomimetici a struttura saccaridica

42 (vantaggi: facile sintesi, notevole resistenza chimica ed enzimatica) Glicomimetici: building block utili per mimici di oligosaccaridi contenenti legami alternativi ai legami glicosidici Esempi di sugar amino acids (SAA, secondo Kessler) Mimici di oligosaccaridi in cui i normali legami glicosidici sono sostituiti con legami ammidici sono detti carbopeptoidi

43 Un esempio di sugar amino acid (SAA) presente in natura: l acido sialico Considerati i loro notevoli vantaggi, gli SAA sono molto utili per generare librerie di glicomimetici Facilità di sintesi, maggiore biodisponibilità associata a proprietà di riconoscimento pressoché invariate

44 Glicomimetici come building block da utilizzarsi in schemi di sintesi peptidica per preparare glico-coniugati Inibitore della riduttasi ribonucleotidica di mammiferi disegnato intorno ad uno scaffold di SAA piranosidico, mimico del β-turn della sequenza Ac-Phe-Thr-Leu-Asp-Ala-Asp-Phe-OH

45 Esempio di oligomero misto SAA-peptide non ciclico con struttura β-hairpin di Jacques van Boom Il residuo di SAA al centro della sequenza riportata impone una forte restrizione conformazionale al peptide, che assume una struttura tipo β-hairpin, tipicamente osservata solo in sequenze cicliche