Valutazione dell efficacia di formulati per impregnazione e di materiali impregnati
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1 APPLICAZIONE DEL NUOVO REGOLAMENTO SUI BIOCIDI: NOVITÀ IN MATERIA DI VALUTAZIONE PER SOSTANZE E PRODOTTI 19 dicembre 2013 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ Centro Nazionale Sostanze Chimiche Valutazione dell efficacia di formulati per impregnazione e di materiali impregnati Luciano Toma e Roberto Romi Reparto di Malattie Trasmesse da Vettori e Sanità Internazionale Dipartimento di Malattie Infettive Parassitarie e Immunomediate I.S.S.
2 REGOLAMENTO (UE) n. 528/2012 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 22 maggio 2012 Articolo 3 Definizioni 1. Ai fini del presente regolamento si intendono per: «biocidi»: qualsiasi sostanza o miscela nella forma in cui è fornita all utilizzatore, costituita da, contenenti o capaci di generare uno o più principi attivi, allo scopo di distruggere, eliminare e rendere innocuo, impedire l azione o esercitare altro effetto di controllo su qualsiasi organismo nocivo, con qualsiasi mezzo diverso dalla mera azione fisica o meccanica. Un articolo trattato/impregnato che abbia una funzione primaria biocida è considerato biocida.
3 Il trattamento dei materiali con principi attivi insetticidi o repellenti è una soluzione volta a ridurre al minimo il contatto tra uomo e artropodi ematofagi (soprattutto zanzare e zecche ) vettori di malattie. Indossare capi trattati oppure usare zanzariere e tende impregnate con insetticidi nelle immediate vicinanze del luogo in cui si vive, sono misure messe a punto in origine come misura di profilassi personale soprattutto contro la malaria e altre malattie trasmesse da zanzare (febbre gialla, dengue..), ma utili ovunque si abbia la reale necessità di proteggersi da artropodi vettori di agenti patogeni per l uomo. Da: Foto F.Severini
4 Le comuni misure internazionali di profilassi includono anche l impiego di repellenti (zanzariere e di abiti impregnati), ma: -l impregnazione con repellenti esplica una azione incompleta e limitata nel tempo soprattutto in presenza di forte traspirazione (attività umana diurna) e /o di precipitazioni; -invece, l impregnazione dei tessuti con insetticidi sembra garantire una migliore protezione (anche per l effetto in parte abbattente). L impiego di questi presidi, sebbene possibile anche nel nostro paese, in teoria dovrebbe essere riservato a reali situazioni di rischio, piuttosto che all impiego contro artropodi che arrecano prevalentemente fastidio.
5 cosa si intende per situazioni a rischio, in Italia? Esempio 1: TBE o encefalite virale da zecche Malattia infettiva a eziologia virale, potenzialmente grave per l uomo, trasmessa principalmente tramite la puntura di zecche (in Italia Ixodes ricinus o zecca dei boschi). La malattia segnalata dal 1992 in Trentino (zona laghi di Lamar), dal 1994 nel bellunese e dal 2001 anche nella provincia di Treviso. È presente dal 1998 in Friuli Venezia Giulia (nelle province di Pordenone e Udine) e, a partire dal 2001, è stata rilevata in focolai circoscritti a Bolzano. Esempio 2: Borreliosi o Malattia di Lyme La malattia di Lyme, conosciuta anche come borreliosi, è una malattia batterica. Si sta assistendo, su scala mondiale, a un progressivo e costante aumento d incidenza. Da:
6 cosa si intende per situazioni a rischio? Esempio: TBE e Malattia di Lyme In caso di permanenza o di escursioni in aree a rischio, è consigliabile. Sulle parti scoperte del corpo è utile l applicazione di prodotti repellenti per gli insetti a base di N,N-dietil-n-toluamide (DEET), di dimetil-ftalato, benzoato di benzile, di permetrina e di acaricidi, ripetendola, se necessario (ad esempio in caso di sudorazione intensa), ogni 2-3 ore. I repellenti a base di DEET e gli insetticidi a base di permetrina possono, pur se con precauzione, anche essere spruzzati sui vestiti. Tratto da: Circolare n. 10 del 13 luglio Malattie trasmesse da zecche: cenni di epidemiologia misure di prevenzione
7 La permetrina è, ad oggi, praticamente l unico insetticida impiegato per questo tipo di uso. Questo p.a. si fissa ai tessuti in modo persistente così da trasferirsi sulla pelle in quantità minima e tale da resistere bene ai lavaggi. Negli USA e in alcuni Paesi europei sono da tempo in commercio prodotti a base di permetrina per attrezzatura da campeggio. Anche la deltametrina viene impiegata per usi simili, soprattutto per impregnare le zanzariere e in genere articoli che non vengono direttamente a contatto con la pelle.
8 Da oltre 20 anni l esercito degli Stati Uniti sta usando la permetrina per le uniformi da combattimento per proteggere I soldati dalle malattie trasmesse da artropodi vettori (zanzare e zecche).
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11 Indumenti trattati o prodotti a base di permetrina per trattare i tessuti : è opportuno tenere presenti alcuni punti: Leggere attentamente le istruzioni d uso e di applicazione riportate in etichetta per evitare di super-trattare I tessuti o viceversa; Non tutti i prodotti a base di permetrina sono idonei a trattare materiali (indumenti per es.): occorre fare attenzione a quelli specifici per questo uso (quando saranno disponibili); I trattamenti con permetrina sono diretti solo ai materiali indicati, e per nessun motivo dovranno interessare la pelle. Non si trattano gli indumenti mentre ci si accinge a indossarli. Il prodotto va applicato all aperto in un luogo ventilato e protetto dal vento. Gli indumenti appena trattati vanno lasciati all aperto fino a che non si asciughino. Gli indumenti trattati vanno lavati separatamente da quelli non trattati. Foto: L.Toma
12 Regolamento 528/2012: CAPO I AMBITO DI APPLICAZIONE E DEFINIZIONI Articolo 1 Scopo e oggetto 1. Il presente regolamento ha lo scopo di migliorare il funzionamento del mercato interno attraverso l armonizzazione delle norme relative alla messa a disposizione sul mercato e all uso dei biocidi, garantendo al contempo un elevato livello di tutela della salute umana e animale e dell ambiente. Le disposizioni del presente regolamento si fondano sul principio di precauzione, nell ottica di tutelare la salute umana, la salute animale e l ambiente. La tutela dei gruppi vulnerabili è oggetto di particolare attenzione. 2. Il presente regolamento disciplina: a) la creazione, a livello di Unione, di un elenco di principi attivi utilizzabili nei biocidi; b) l autorizzazione dei biocidi; c) il riconoscimento reciproco delle autorizzazioni all interno dell Unione; d) la messa a disposizione sul mercato e l uso di biocidi all interno di uno o più Stati membri o dell Unione; e) l immissione sul mercato di articoli trattati.
13 Immissione sul mercato di articoli trattati (da: CAPO XIII: ARTICOLI TRATTATI : Articolo 58) Gli articoli trattati sono immessi sul mercato unicamente se tutti i principi attivi contenuti nei biocidi con cui sono stati trattati, o che essi contengono, sono iscritti nell elenco stilato conformemente all articolo 9, paragrafo 2 (approvazione di un p.a.) per il tipo di prodotto e l uso pertinenti, oppure nell allegato I, e sono soddisfatte le condizioni o limitazioni ivi specificate. L etichetta deve recare le seguenti informazioni: - una menzione indicante che l articolo trattato contiene biocidi; - se confermata, la proprietà biocida attribuita all articolo trattato; - eventuali pertinenti istruzioni per l uso, comprese le opportune precauzioni da prendere a causa dei biocidi con i quali l articolo è stato trattato o in esso contenuti; - le eventuali precauzioni necessarie per la tutela dell uomo, degli animali o dell ambiente.
14 VALUTAZIONE DELL EFFICACIA Su quali basi vengono effettuati i test di efficacia su questo tipo di prodotti?... little information is provided on attractants (e.g. sex pheromones etc.) and treated articles (e.g. insecticide treated mosquito nets etc.). These data gaps will be filled in the next version of this guidance. DRAFT Guidance to replace part of Appendices to chapter 7 (page 187 to 200) from TNsG on Product evaluation 2012
15 Valutazione dell efficacia di tessuti impregnati con permetrina secondo standard WHO Per la valutazione dell efficacia ci viene in aiuto lo standard del WHO che ad oggi rappresenta oltre ai protocolli EPA, l insieme delle linee guida per condurre saggi mirati e riproducibili
16 Fase 1 Saggi di laboratorio Le procedure riportate si riferiscono sempre a saggi su materiale trattato e non sulla soluzione per trattarli La concentrazione di p.a. (permetrina) deve essere contenuta entro il 25% ; Resistenza al lavaggio Saggi di efficacia su campioni di tessuto trattati a 0, 1, 5, 10, 15 e 20 lavaggi secondo standard WHO e asciugati a 30 C; ne deriva curva di regressione costruita su % mortalità e numero di lavaggi che la determinano (abbattimento o knock down, 80% dopo 24 ore e/o 95% dopo 1 ora ).
17 Fase 1 Saggi di laboratorio Cosa vuol dire procedura standard di lavaggio WHO: Campioni di tessuto 25cm x 25cm inseriti singolarmente in beakers da 1 litro, contenenti 0,5 litri di acqua distillata con sapone di Marsiglia 2 g/l; i beakers vengono introdotti in acqua a 30 C e mantenuti in agitazione per 10 minuti a 155 movimenti al minuto; i campioni vengono sciacquati due volte per 10 minuti in acqua distillata nelle stesse condizioni di agitazione; Tra un lavaggio e l altro i campioni vengono asciugati a temperatura ambiente e sistemati a 30 C, al buio.
18 Saggi di Efficacia WHO a contatto forzato (messi a punto per il genere Anopheles) Vengono selezionate 5 zanzare adulte, di 2-5 giorni di età, che non abbiano effettuato pasto di sangue e che non presentino resistenza al p.a. Le zanzare vengono poste sul tessuto trattato per 3 minuti sotto coni standard WHO, per poi essere nutrite con una soluzione zuccherina. L abbattimento viene registrato dopo 1 ora e la mortalità dopo 24 ore. Vengono ripetute almeno 10 repliche (50 zanzare) per ciascun campione di tessuto, per 4 campioni (5 x10 x 4 = 200 zanzare). Si affianca sempre un controllo con l esposizione di zanzare su tessuto non trattato. Il saggio va condotto a T=25 ± 2 C e con 75 ± 10% di umidità relativa. I campioni lavati almeno 20 volte, che causano 80% mortalità e/o 95% di KD, introducono alla fase di semi-campo.
19 Saggi di Efficacia con tunnel test Per evitare di sottostimare l efficacia del tessuto trattato, viene effettuato anche il tunnel test: viene registrata la mortalità e l inibizione a pungere per nutrirsi di sangue. Viene saggiata l efficacia dei campioni lavati 20 volte, rilasciando nel tunnel 100 zanzare femmine senza pasto di sangue e di 5-8 giorni di età; Il tunnel è lungo 60cm e largo 25: a 1/3 della lunghezza è posto un setto con un campione trattato 20cm x 20cm, forato con buchi di 1cm; dalla parte opposta del tunnel è posto un animale esca, che le zanzare possono raggiungere solo attraversando il setto trattato; l esperimento si protrae dal tardo pomeriggio fino al mattino. Si registra la mortalità immediata, mentre le zanzare ancora vive vengono mantenute a 27 C e a 80% di umidità relativa per registrare la mortalità a 24 ore. Tutto l esperimento viene condotto anche in un tunnel con tessuto non trattato. I campioni lavati almeno 20 volte, che causano 80% mortalità e/o inibizione a pungere 95%, introducono alla fase di semi-campo.
20 Prove di semi campo e campo L efficacia di tessuti trattati, intesa in termini di inibizione della attività trofica su ospite, deterrenza e mortalità, viene provata in situazioni simili a quelle reali, magari ricostruite in una stanza o ricovero artificiale, utilizzando zanzare selvatiche, sensibili all insetticida e libere di volare in tale ambiente. Tale prova implica anche l osservazione in presenza dell ospite esca (animale o uomo). Nella prova di campo si registrano i risultati in presenza delle variabili reali e con le zanzare selvatiche libere di entrare in contatto o meno con i materiali trattati con insetticida. Il tipo di materiale trattato orienta diversamente di volta in volta il tipo e le modalità con cui condurre l esperimento.
21 Saggio di laboratorio condotto in ISS..in passato: Impregnazione di abiti con permetrina come mezzo per la protezione di personale professionalmente esposto al contatto con artropodi ematofagi (Annali di Igiene, 1997; 9: ). Un lavoro del 1997 di Romi et al., riportale le prove di laboratorio per l impregnazione di abiti con permetrina (secondo standard WHO) per valutarne l efficacia protettiva rispetto ad artropodi ematofagi come zanzare e zecche. Uniformi mimetiche da combattimento dell Esercito Italiano furono impregnate con permetrina in ragione di 0,12-0,15 mg/cm 2
22 L esame gascromatografico mostrò che oltre il 50% del p.a. (0,06-0,07mg/cm 2 ) rimane nella stoffa anche dopo 6 lavaggi (effettuati con lavatrici usate nei campi militari); questa quantità risultò essere sufficiente ad assicurare una buona protezione contro la zanzara Aedes aegypti e contro la zecca dei boschi Ixodes ricinus che sono state usate come specie di studio. Gli artropodi studiati sono stati esposti alle uniformi trattate per tempi variabili: 30-3 per le zanzare e 3-5 per le zecche; come risultato, sebbene l effetto abbattente sia andato riducendosi con i lavaggi, la mortalità rimase sempre del 100% per Ae. aegypti e di oltre il 90% per I. ricinus. Ixodes ricinus Aedes aegypti
23 Esempio di prova di laboratorio per articoli trattati con p.a. repellenti (braccialetti e simili) Un prodotto in materiale impregnato con un p.a. repellente (inserito in Allegato I ), proposto per la protezione individuale dalle zanzare, per esempio, richiede ovviamente una opportuna prova per dimostrarne l efficacia nei termini che si vogliono riportare in etichetta. Un numero noto di zanzare viene posto in una struttura dove queste possano spostarsi verso l ospite (mano); L odore dell ospite viene portato alla gabbia da una leggera corrente d aria; Tutte le zanzare hanno modo di volare controvento per raggiungere la mano: controllo positivo. Per gentile concessione di Entostudio s.n.c. Per gentile concessione di Entostudio s.n.c.
24 In presenza del prodotto trattato con p.a. repellente, le zanzare sono libere di raggiungere la mano ma una parte ne sarà disturbata; Le zanzare che raggiungono l estremità del tubo verso la mano vengono contate; Si effettuano dalle 3 alle 5 repliche. Per gentile concessione di Entostudio s.n.c.
25 Nel nostro Paese esistono oggi in commercio oggetti (braccialetti e simili..) trattati con repellenti quali essenza di citronella, geraniolo, olio di Neem, ecc.. Nei casi migliori, in termini di effetto repellente, si tratta di supporti o taschine per ricariche di materiale assorbente che diffondono le essenze; In alcuni casi si parla di repellente fuso nel materiale di cui è costituito il prodotto; ciò lascia molti dubbi sulla reale efficacia poichè è noto che il repellente per avere effetto deve evaporare, diffondersi per scoraggiare l avvicinarsi dell artropode target. Foto F.Severini
26 Considerazioni e conclusioni 1 L efficacia dei prodotti trattati con insetticidi o repellenti può variare in base al tipo di materiale di supporto e agli usi per cui sono destinati; test e valutazione specifiche. I test di efficacia di un materiale trattato vanno condotti sul prodotto finito, cioè sull articolo trattato e non sul prodotto/p.a. usato per trattarlo. i materiali trattati dovrebbero essere limitati ad usi specifici e non generici (cioè non di uso quotidiano e in qualsiasi luogo), senza entrare nella distinzione tra uso professionale e non professionale.
27 Considerazioni e conclusioni 2 Regolamento 528/2012: Se da un lato alcuni aspetti risultano più chiari rispetto al passato (es. claim), altri rimangono oscuri e irrisolti (es. riferimento a una regolamentazione dei test d efficacia).
28 Si ringraziano: Laura Fornarelli CSC, Istituto Superiore di Sanità Francesco Severini Dip. MIPI, Istituto Superiore di Sanità Marco di Luca Dip. MIPI, Istituto Superiore di Sanità Simone Martini Entostudio s.n.c. Andrea Drago Entostudio s.n.c.
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