ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI ms-hsc (MUSCLE DERIVED HEMATOPOIETIC STEM CELLS) IN HIRUDO MEDICINALIS

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Olivia Buono
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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DELL INSUBRIA FACOLTA DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI VARESE Corso di Laurea Triennale in Biologia Sanitaria ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI ms-hsc (MUSCLE DERIVED HEMATOPOIETIC STEM CELLS) IN HIRUDO MEDICINALIS Relatore: Dott.ssa Annalisa GRIMALDI Correlatore: Dott. Gianluca TETTAMANTI Tesi di Laurea di: ALABARDI LAURA Matr ANNO ACCADEMICO

2 INTRODUZIONE Recenti dati hanno dimostrato l esistenza di precursori mio-endoteliali negli spazi interstiziali del muscolo scheletrico di topo (Tamaki et al., 2002). Queste stem cells sono distinte dalle cellule satelliti, sono localizzate fuori dalla lamina basale che circonda il sarcolemma ed esprimono un marker delle cellule endoteliali e dei precursori ematopoietici, il CD34. Queste cellule sono potenti precursori miogenici responsabili del processo rigenerativo e della crescita postnatale del muscolo. Nel tessuto muscolare adulto è quindi presente una popolazione di stem cells che contribuisce alla formazione di nuove fibre muscolari ed è responsabile della riparazione della ferita. Tutto ciò suggerisce che le cellule CD34 + siano stem cell multipotenti che hanno mantenuto la capacità di differenziarsi sia in cellule endoteliali che muscolari a seconda del tipo di segnale fornito dal tessuto circostante. Fino ad ora, tuttavia, non è ancora noto quali siano i meccanismi che regolano il differenziamento in uno dei tipi cellulari. La nostra ricerca è stata condotta sulla sanguisuga Hirudo medicinalis. Questo modello animale è stato scelto per la sua semplicità strutturale e la sorprendente somiglianza con i vertebrati sia dal punto di vista morfologico che dei meccanismi molecolari che regolano il processo di riparazione della ferita e di differenziamento dei precursori delle cellule ematopoietiche ed endoteliali (de Eguileor et al., 2001 b; Tettamanti et al., 2005; Grimaldi et al., 2006). 2

3 Hirudo medicinalis Il corpo delle sanguisughe è appiattito dorso-ventralmente, sono provviste di una ventosa anteriore attorno alla bocca ed una posteriore più grande. Gli Irudinei sono ematofagi e le ventose sono usate sia per la locomozione a compasso sia per l adesione ad ospiti o prede. Il corpo è rivestito esternamente da una cuticola secreta dalle cellule epidermiche sottostanti. H. medicinalis è un invertebrato caratterizzato da una struttura anatomica relativamente semplice. Il sacco muscolo-cutaneo è particolarmente spesso e presenta tre robusti strati muscolari (circolari, obliqui e longitudinali) che sono formati da fibre elicoidali e garantiscono all animale una notevole estensibilità fino a cinque volte quella di riposo (Lanzavecchia et al.,1985). Il celoma si presenta notevolmente ridotto ed il corpo dell animale è occupato da un tessuto connettivale lasso. Attorno al tubo digerente si organizzano sia il sistema circolatorio che il tessuto botroidale e vasofibroso. Angiogenesi ed Ematopoiesi in H. medicinalis H. medicinalis è caratterizzata dalla presenza di un particolare tessuto coinvolto nel processo di angiogenesi ed ematopoiesi: il tessuto botroidale. Il tessuto botrioidale Il tessuto botroidale è un tessuto mieloeritroide localizzato nel parenchima, tra l intestino e la parete corporea. Queste cellule si comportano come un compartimento di deposito di mucopolisaccaridi, ferro e lipidi. Questo tessuto, costituito da cellule endoteliali (EC) e da cellule botroidali che presentano un citoplasma ricco di granuli, gioca un ruolo di primaria importanza nel processo di angiogenesi. Infatti, in condizioni normali ma soprattutto in 3

4 seguito a stimoli di varia natura, il tessuto botroidale è in grado di cambiare forma passando da un cordone solido di cellule ad una vera e propria struttura vascolare. Adese alle pareti del neo lume sono evidenti gruppi di piccole cellule strettamente associate, che costituiscono i precursori delle cellule circolanti. Quando i vasi crescono, i precursori iniziano progressivamente a perdere i contatti cellula-cellula e cominciano a circolare liberamente dentro il lume (de Eguileor et al., 2001 a). In caso di lesioni, cioè di stimolazione del sistema immunitario, molti dei precursori possono aderire alla parete luminale del vaso e con la diapedesi disperdersi nel tessuto connettivo circostante. I precursori ematopoietici sono stati caratterizzati attraverso l espressione di marcatori superficiali che possono essere specifici o condivisi anche dalle cellule endoteliali. L espressione di queste proteine marker, che può aumentare in seguito a stimolazione, gioca un ruolo molto importante nelle diverse funzioni leucocitarie come differenziamento, maturazione, migrazione ed interazioni cellula-cellula. Ad esempio CD45 è il primo marcatore che compare durante la maturazione di queste cellule, CD33 e CD34 sono espressi sull endotelio vascolare e sui precursori ematopoietici mieloidi, CD117 è coinvolto nell ematopoiesi ed è espresso su cellule circolanti pluripotenti, CD31 è coinvolto negli eventi di angiogenesi e di riparazione delle ferite ed è espresso sulle cellule circolanti, monociti, granulociti, cellule endoteliali (de Eguileor et al., 2003; de Eguileor et al., 2004; Grimaldi et al., 2006). Citochine in H. medicinalis Il processo di angiogenesi ed ematopoiesi in H. medicinalis mostra una sorprendente somiglianza con i vertebrati. Infatti sono evidenti interazioni cellula-cellula e cellulamatrice (Tettamanti et al., 2003) e sono coinvolte le stesse molecole segnale (de Eguileor et al., 2004; Grimaldi et al., 2006). 4

5 Il Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), l'epidermal Growth Factor (EGF), il basic Fibroblast Growth Factor (bfgf) ed il Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), rilasciati nei vertebrati da macrofagi, cellule endoteliali e fibroblasti, rappresentano i più potenti fattori angiogenici nelle sanguisughe. Come accade nei vertebrati, queste proteine funzionano come mezzo di comunicazione tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM), stimolando così chemoattrazione, proliferazione, secrezione e migrazione cellulare. L espressione di questi mediatori e dei loro recettori varia quantitativamente e qualitativamente durante il corso della formazione dei vasi in seguito alle diverse stimolazioni (lesioni chirurgiche, trapianti o iniezione di fattori di crescita) (de Eguileor et al., 2004). Vascular Endothelial Growth Factor In H. medicinalis il VEGF viene sintetizzato ed accumulato all interno del citoplasma delle fibre muscolari e nelle cellule vasofibrose. Quando viene rilasciato nella ECM induce la formazione di nuovi vasi a partire da quelli preesistenti o dal tessuto botroidale (Tettamanti et al., 2003). Inoltre la somministrazione di VEGF determina in H. medicinalis non solo la formazione di neovasi ma anche l aumento numerico dei precursori ematopoietici circolanti (Tettamanti et al., 2003). Recentemente è stato dimostrato, nei vertebrati, che il VEGF 165 (la più abbondante ed attiva delle 5 isoforme) gioca anche un ruolo fondamentale nella migrazione di stem cell CD34 + dal midollo osseo verso il sito di richiamo (Lee e altri, 2006). Queste cellule, a seconda del tessuto in cui migrano, possono differenziare in cellule ematopoietiche, endoteliali e muscolari (Sutherlands et al., 1988; 1993). 5

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