Iperestrogenismo, ipofertilità.

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1 1. INTRDUZINE Micotossina è il nome generalmente dato ad un metabolita secondario, prodotto da micromiceti tossigeni, che svolge azione tossica acuta o cronica nell organismo animale. L ingestione di micotossine da parte dell uomo avviene principalmente attraverso alimenti contaminati di origine vegetale. I cereali e i semi delle piante oleaginose, e tutti i loro derivati e sottoprodotti, nonché diversi altri alimenti di origine vegetale, possono essere contaminati da funghi e micotossine. Queste ultime, infatti, sono caratterizzate da termostabilità, fotostabilità e permanenza negli alimenti anche dopo la morte dei miceti che le hanno generate. Tuttavia, anche alimenti di origine animale possono essere contaminati da funghi e micotossine; oppure, prodotti metabolici delle micotossine possono trovarsi in alimenti derivanti da animali a loro volta esposti alle micotossine. ltre agli effetti tossici delle micotossine associati alle micotossicosi, possono essere prodotti effetti genotossici nell organismo animale: azione mutagena, cancerogena e teratogena. In particolare, si è posta molta attenzione alla possibile azione cancerogena delle micotossine. Le aflatossine, che sono prodotte da specie tossigene del genere Aspergillus, sono considerate le micotossine con una più accentuata attività cancerogena. Tuttavia, altre micotossine, quali la sterigmatocistina, le ocratossine, le fumonisine e lo zearalenone, hanno dimostrato attività cancerogena, anche elevata, in animali di laboratorio; inoltre, per alcune di queste, si sono ottenute indicazioni di una possibile azione cancerogena nell uomo. La diagnosi di micotossicosi nell uomo e negli animali è resa difficile da: diffusione ubiquitaria di molti funghi patogeni o potenzialmente patogeni; potenziale concomitante produzione di metaboliti tossici da parte di diversi miceti; limitata specificità dei sintomi riscontrati nelle micotossicosi. Ne deriva che la diagnosi di micotossicosi si basa principalmente sulla identificazione negli alimenti delle micotossine, poiché i sintomi da esse prodotti spesso non sono facilmente attribuibili ad una particolare micotossicosi. Essendo le micotossine dei contaminanti naturali, la cui eliminazione totale è in pratica impossibile, esiste un generale interesse rivolto a contenere le contaminazioni da micotossine, in alimenti destinati sia all uomo sia agli animali in produzione zootecnica, a livelli tali da non rappresentare un problema per la salute umana. Interventi preventivi contro lo sviluppo di funghi tossigeni, sulla coltura in campo o sulle derrate alimentari durante la loro conservazione e trasformazione, possono indubbiamente essere efficaci per limitare le contaminazioni alimentari da micotossine. L individuazione precoce di funghi tossigeni, mediante metodi diagnostici rapidi ed efficaci, offre buone prospettive di prevenzione, permettendo di intervenire in tempi adeguati con opportuni mezzi di lotta contro il microrganismo tossigeno. Tutto questo è avvalorato dal fatto che, ad oggi, non esistono metodi efficaci per detossificare un alimento senza alterarne le proprietà nutrizionali ed organolettiche. Pertanto, l unica via possibile per garantire prodotti sicuri è la prevenzione in tutte le fasi della filiera agroalimentare. 1

2 MICTSSINE Aflatossine: -B 1, B 2, G 1, G 2, FUNG PRDUTTRE Flavus, Parasiticus, altre Aspergillus Spp. Metaboliti EFFETT TSSIC Epatiti, nefriti, tumori. ALIMENT CNTAMINAT Arachidi, pistacchi, leguminose, mais ed altri cereali, semi oleosi, noci e mandorle, uva. -M 1, M 2 Zearalenoni: -zearalenone -zearalenolo cratossine: -ocratossina A F. roseum, F. tricinctum, F. moniliforme e altre Fusarium spp. Aspergillus ocraceus, Penicillium viridicatum, altri Aspergillus spp. e Penicillium spp. Iperestrogenismo, ipofertilità. Nefriti, epatiti. Latte e suoi derivati (yogurt, formaggi e burro). Mais, sorgo e altri cereali, frutta, vegetali. rzo, mais ed altri cereali, pane, pasta ed altri prodotti da forno (dolci), uva, spezie (pepe nero, paprika), -ocratossina B Tricoteceni: -tossina T 2 F. rosum, F. solani, F. tricintum e altri Fusarium spp. Emorragie, leucopenie, disturbi nervosi. Vomito e rifiuto del cibo. Mais, orzo ed altri cereali, derivati di frutta (arance, uva, mele), vegetali (pomodori). -deossinvalenolo -diacetossiscirpenolo -nivalenolo Rubratossina: -rubratossina A P. rubrum, P. purpurogenum, altri Penicillium spp. Emorragia, degenerazione epatica. Mais ed altri cereali. -rubratossina B Citrina Penicillium spp. Epatiti, nefriti. Cereali. Patulina P. patulum, altre Emorragie renali ed Penicillium spp e epatiche, Aspergillus spp. nefrotossicosi. Cereali, succo di mela, insilati, sottoprodotti molitori. Fumonisine Fusarium spp. Cancro esofageo. Mais, grano e suoi derivati. Principali micotossine e micotossicosi Le aflatossine sono prodotte, principalmente, dall Aspergillus flavus e dall Aspergillus parasiticus. Le aflatossine B sono bifuranocumarine fuse con un anello ciclopentenoico; le aflatossine G sono bifuranocumarine fuse con un anello -lattonico; le aflatossine M sono prodotti metabolici tossici delle aflatossine B e G, e si possono trovare nel latte e nei prodotti lattiero-caseari. All estremità degli anelli furanici delle aflatossine B 1, G 1 ed M 1, è presente un doppio legame che si correla con un elevata tossicità. Le aflatossine causano micotossicosi nell uomo e negli animali, e sono cancerogene dopo prolungata esposizione, esplicando la loro azione soprattutto a livello epatico. 2

3 CH 3 CH 3 Aflatossina B 1 Aflatossina B 2 CH 3 CH 3 Aflatossina G 1 Aflatossina G 2 H H CH 3 CH 3 Aflatossina M 1 Aflatossina M 2 Figura 1. Formule di struttura delle principali aflatossine Numerosi studi sono stati condotti per identificare i passaggi enzimatici e i meccanismi regolativi della biosintesi delle micotossine. La via biosintetica di gran lunga più studiata e più conosciuta è quella delle aflatossine. La biosintesi delle aflatossine è un processo multienzimatico altamente regolato, controllato da più di 20 geni. La biosintesi delle aflatossine è inoltre influenzata da una molteplicità di fattori ambientali e nutrizionali, che possono favorire o sfavorire la biosintesi. Si ritiene che tali fattori possano modulare l espressione di un gene regolatore, aflr, il cui prodotto, l AFLR (Aflatoxin Regulator), è un fattore di trascrizione zincodipendente che regola l espressione dei geni che codificano per gli enzimi preposti alla biosintesi delle aflatossine. Il principale motivo strutturale, contenente lo zinco, dell AFLR è coinvolto nel legame di questa proteina regolatrice a specifiche sequenze bersaglio del DNA. 2. SCP DELLA RICERCA Ci si è proposti di ottenere l AFLR in forma ricombinante, al fine di poterne studiare più dettagliatamente le proprietà regolative nella biosintesi delle aflatossine. Infatti, questa proteina è presente solo in tracce nelle fonti naturali e il metodo migliore per ottenerne quantità sufficienti per la sua caratterizzazione è quello della sovraespressione in forma ricombinante in microrganismi di espressione come batteri e lieviti. Come primo approccio abbiamo utilizzato l espressione in Escherichia coli, che è il microrganismo più sfruttato nelle tecnologie del DNA ricombinante. 3

4 3. RISULTATI 3.1 Clonaggio di AFLR in vettore pgem-t Easy Il cdna codificante per l AFLR di Aspergillus parasiticus è stato amplificato mediante PCR utilizzando due primers, uno dei quali è stato costruito sulla base della sequenza nota del cdna d interesse (ADRI 1). Questo primer specifico garantisce che il prodotto di amplificazione presenti all estremità 5 il sito di taglio per l enzima NdeI. I due primers sono stati scelti in modo tale che le loro temperature di appaiamento fossero simili. Il frammento amplificato è stato clonato in pgem-t Easy, un vettore plasmidico che presenta un alta efficienza di replicazione. Il plasmidio pgem-aflr così ottenuto è stato utilizzato per la trasformazione di cellule di E. coli XL1B mediante elettroporazione. 3.2 Clonaggio e prove di espressione nel vettore pet 11b Il frammento nucleotidico, clonato in pgem-t Easy, è stato tagliato con appropriate endonucleasi di restrizione NdeI e BamHI, i cui siti di restrizione sono presenti a monte e a valle della sequenza codificante, al fine del clonaggio nel vettore plasmidico pet 11b. Questo vettore presenta i promotori per l espressione della proteina. L inserto è stato, quindi, utilizzato per la reazione catalizzata dalla ligasi, al fine di ottenere il plasmidio pet 11b-AFLR, che è stato impiegato per la trasformazione di E. coli XL1B mediante elettroporazione. Le prove di espressione di AFLR da parte di cellule di E. coli BL21, anch esse trasformate per elettroporazione, si sono eseguite in terreno LB e in presenza dell agente inducente IPTG. Il risultato di questa prova di espressione è mostrato in figura 2. Il confronto dei campioni di coltura cellulare non indotta e indotta ha permesso di evidenziare solo una piccola banda, che diversificava i due campioni. Tale banda corrispondeva a effettivamente al peso molecolare dell AFLR (47 kda), ma presentava un intensità piuttosto limitata. Per verificare la specifica sequenza del cdna e la sua corretta inserzione nel vettore d espressione si è proceduto con il sequenziamento di pet 11b-AFLR con il metodo di Sanger, grazie all impiego di primers universali e di primers appositamente costruiti. Dall analisi della sequenza nucleotidica e della corrispondente sequenza amminoacidica, si è trovato che il cdna codificante per AFLR era identico a quello presente in GenBank (codice di accesso L26222), e risultava correttamente inserito nel vettore pet 11b. La limitata induzione osservata per AFLR in pet 11b nel ceppo BL21 di E. coli potrebbe essere attribuibile alla presenza, nella sequenza nucleotidica d interesse, di codoni poco utilizzati dalle cellule batteriche (codoni rari). In questo caso la presenza di quantità limitate dei trna specifici in grado di riconoscere questi codoni potrebbe rappresentare il fattore limitante l espressione della proteina eterologa. Al fine di ovviare a questa possibile limitazione, si è proceduto alla trasformazione, mediante elettroporazione, del ceppo BL21-CodonPlus-RIL di E. coli, caratterizzato dalla presenza di un plasmidio addizionale che contiene i geni codificanti per i trna di arginina, isoleucina e leucina (codoni AGA/AGG, AUA e CUA); sono state, quindi, condotte prove di espressione di AFLR con il suddetto ceppo in terreno LB e in presenza di IPTG. La presenza di una maggiore quantità di questi specifici trna non ha però influenzato positivamente l espressione della proteina eterologa. 4

5 3.3 Clonaggio e prove di espressione nel vettore pet 28b Al fine di verificare che la banda elettroforetica osservata per il campione di coltura indotta, corrispondente al peso molecolare atteso, fosse attribuibile effettivamente ad AFLR e non ad una proteina batterica, si è proceduto con il clonaggio in pet 28b; questo plasmidio è tale che la proteina d interesse viene fusa ad una coda di sei istidine rivelabili mediante l impiego di anticorpi specifici. Il frammento nucleotidico, clonato in pgem-t Easy, è stato tagliato con l endonucleasi di restrizione NdeI, i cui siti di restrizione sono presenti uno sull inserto e uno sul vettore a monte della sequenza d interesse, per poter essere inserito nel vettore d espressione pet 28b. Dopo purificazione su gel di agarosio, il frammento è stato utilizzato per la reazione catalizzata dalla ligasi, al fine di ottenere il plasmidio pet 28b-AFLR che è stato impiegato per la trasformazione, mediante elettroporazione, di cellule di E. coli XL1B. Anche in questo caso l espressione si è ottenuta con l impiego del ceppo BL21 di E. coli. Prove preliminari di espressione in terreno di coltura LB e in presenza di IPTG non hanno permesso di individuare alcuna banda elettroforetica, corrispondente al peso molecolare atteso, che diversificasse campione indotto e non indotto. Come controllo, si è anche proceduto con il sequenziamento di pet 28b-AFLR, e si è verificata la correttezza del clonaggio eseguito. 3.4 Western Blotting Al fine di stabilire in modo univoco la espressione di AFLR contenente la coda di sei istidine, si è proceduto col Western Blotting, saggio immunologico che è in grado di rivelare anche tracce di una specifica proteina in una miscela molto eterogenea. In questo saggio le proteine antigeniche di una miscela sono analizzate con gli anticorpi specifici, dopo averle separate mediante elettroforesi monodimensionale su gel denaturante (SDS-PAGE). Dopo elettroforesi il gel è posto a contatto con un filtro di nitrocellulosa e le proteine sono trasferite (blotted) su questo filtro in presenza di un adeguato campo elettrico. Le proteine si legano irreversibilmente al filtro di nitrocellulosa, e la formazione del complesso tra antigene ed anticorpo primario può essere visualizzata dopo esposizione del filtro ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo), marcato con l enzima rivelatore per ossidasi. Con questa metodica si è effettivamente trovata la presenza di AFLR nel campione analizzato, anche se in quantità limitata, considerata la sensibilità del Western Blotting, che permette di rivelare quantità di proteina nell ambito dei nanogrammi. In figura 3 è mostrato il risultato del Western Blotting eseguito sui campioni di coltura non indotta ed indotta di E. coli trasformati con pet28b-aflr, utilizzando anticorpi specifici per la sequenza di sei istidine. 4. CNCLUSINI La resa dell espressione di AFLR, con le metodiche impiegate, non è risultata soddisfacente ai fini di un possibile studio delle sue proprietà regolative nella biosintesi delle aflatossine. Per incrementare la produzione di proteina si cercherà di migliorare l espressione in E. coli, variando ad esempio i parametri dell induzione (tempi, temperatura e concentrazione dell agente inducente), oppure ci si rivolgerà all espressione in cellule eucariotiche di lievito, microrganismo più vicino filogeneticamente ai miceti. 5

6 kda 33 kda Figura 2. Gel-elettroforesi (SDS-PAGE) che mostra l induzione di AFLR in pet 11b in cellule di E. coli BL21. Sono stati caricati: estratto crudo non indotto (lane 1); estratto crudo indotto (lane 2); marcatori di peso molecolare (lane 3 e 4) kda Figura 3. Risultato del Western Blotting eseguito con l impiego di anticorpi specifici diretti verso la coda di sei istidine legata ad AFLR. Nelle lane 3 e 4 sono stati caricati l estratto crudo non indotto e l estratto crudo indotto, rispettivamente. Nelle lane 1 e 2 è stato caricato un marker di peso molecolare di 40 kda contenente la coda di sei istidine e riconosciuto dagli anticorpi specifici. 6