STRUTTURE O PROCESSI CARATTERISTICI DEI PROCARIOTI, RAPPRESENTANO BUONI BERSAGLI PER GLI ANTIBIOTICI
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- Arturo Grossi
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1 STRUTTURE O PROCESSI CARATTERISTICI DEI PROCARIOTI, RAPPRESENTANO BUONI BERSAGLI PER GLI ANTIBIOTICI Processo di trascrizione (RNA polimerasi diversa) Replicazione e repair del DNA (enzimi diversi) parete batterica (solo procarioti) Sintesi proteica (Ribosomi differenti) Membrane Sintesi dei folati (assente nei mammiferi)
2 Antibiotici beta-lattamici e antibiotici glicopeptidici bloccano la sintesi del peptidoglicano NAG NAG NAG NAM NAM NAM DAP D-A DAP D-A DAP D-A D-A D-A PBP
3 ANTIBIOTICI BETA-LATTAMICI prodotti da funghi (penicilline e cefalosporine) e da batteri (carbapenemi) o di sintesi (monobattami) IL LORO BERSAGLIO E L ENZIMA (PBP che operano transpeptidazione e transglicosilazione per la sintesi del peptidoglicano) Agiscono come pseudosubstrato per le PBP legandosi covalentemente al sito attivo e acilandolo Le PBPs si deacilano con estrema lentezza e risultano quindi inattivate
4 ANTIBIOTICI GLICOPEPTIDICI (gruppo della vancomicina): IL BERSAGLIO E IL SUBSTRATO Gli antibiotici glicopeptidici sono un gruppo vasto (es.vancomicina prodotta da una specie di Amycolatopsis-batterio Gram +) si legano al dipeptide D-Ala - D-Ala e lo mascherano Il substrato non è più disponibile per l azione delle PBP
5 I CHINOLONI (di sintesi) BLOCCANO LA DUPLICAZIONE DEL CROMOSOMA BATTERICO: Si legano alla topoisomerasi-ii E impediscono che il DNA venga rilegato Nella cellula si accumulano frammenti di DNA
6 Le RIFAMICINE prodotte da una specie di Amycolatopsis si legano alla subunità beta delle RNA-polimerasi batteriche Core enzima σ E impediscono la trascrizione genica, perché la RNA polimerasi non può più legarsi al DNA da copiare
7 I RIBOSOMI (LA SINTESI PROTEICA) SONO BERSAGLIO DI MOLTI ANTIBIOTICI E P A Le tetracicline naturali sono prodotte da Streptomiceti, ne sono state anche create molte semisintetiche 30S TETRACICLINE le tetracicline si legano alla subunita 30s deformando il sito A e impediscono l alloggiamento degli AA-tRNA
8 GLI AMINOGLICOSIDI (prodotti da batteri Gram+ di diversi generi del gruppo degli attinomiceti) SI LEGANO ALLA SUBUNITA 30S BLOCCANDO IL COMPLESSO DI INIZIO e impediscono il legame con la subunità 50S e la lettura del messaggero QUANDO LA SINTESI E GIA INIZIATA Gli aminoglicosidi, legandosi al 30S, Rendono permissivo il sito A che accoglie AA-tRNA non corrispondenti ai codoni del mrna vengono quindi sintetizzate proteine con mutazioni che possono renderle non funzionali
9 CLORAMFENICOLO, MACROLIDI E LINCOSAMIDI (da streptomiceti) 50S 30S Competono per il medesimo sito di legame sulla subunità 50S
10 Interferiscono con l azione della peptidil-transferasi bloccando l allungamento della catena F-Met Cloramfenicolo Macrolidi Lincosamidi A1 30S Macrolidi e lincosamidi possono anche fermare lo scorrimento del ribosoma sul messaggero
11 Gli involucri esterni sono critici nei batteri La membrana esterna, tipica dei batteri Gram-negativi, delimita la cellula batterica impedendo l accesso a molti composti La membrana interna è vitale per la produzione di energia e il trasporto dei nutrienti
12 A basse dosi la POLIMIXINA (prodotta da una specie di Bacillus) Disorganizza la membrana esterna sensibilizzando la cellula batterica a componenti del siero o altri antibiotici Mentre a dosi elevate Provoca il collasso della membrana interna e la morte della cellula batterica
13 A differenza di noi, i batteri sintetizzano acido folico Sintesi DNA-RNA PABA acido folico Sintesi proteine I sulfamidici (di sintesi) interferiscono con la biosintesi di acido folico dal PABA Sulfamidico acido folico Sintesi DNA-RNA Sintesi proteine Il Trimethoprim (di sintesi) sostituisce l acido folico e blocca le vie biosintetiche a valle Sintesi DNA-RNA PABA Trimethoprim Sintesi proteine
14 I BATTERI POSSONO DIVENTARE RESISTENTI MECCANISMI BIOCHIMICI FENOMENI BIOLOGICI ENZIMI INATTIVANTI Enzimi β-lattamasi Farmaci inattivati β-lattamici Acetil-transferasi Fosfo-transferasi Adenil-transferasi Aminoglicosidi Acetil-transferasi Cloramfenicolo
15 Le β-lattamasi secrete nello spazio periplasmico, inattivano le penicilline e le cefalosporine prima che si leghino alle PBP O O R H S CH 3 CH3 HN COO - Acido penicilloico (inattivo) β-lattamasi β-lattamico O R H S CH 3 N CH 3 COO - TPasi TGasi TPasi TGasi
16 ENZIMI INATTIVANTI GLI AMINOGLICOSIDI GLI ENZIMI DI MODIFICAZIONE NON DISTRUGGONO LA MOLECOLA MA LA RENDONO INSERVIBILE N-acetilare HO O HN O Enzimi batterici in grado di: O-fosforilare 2- O 3 P AMP-O HO PREVENGONO IL LEGAME DELL ANTIBIOTICO AL RIBOSOMA O-adenilare
17 i microrganismi non sprecano mai energia per questo motivo molti enzimi sono inducibili prodotti solo quando la loro attivita si rende davvero necessaria molti degli enzimi che modificano gli antibiotici sono codificati da geni la cui espressione è regolata
18 Tutti i ceppi di P. aeruginosa hanno nel cromosoma un gene (ampc ) che codifica una β-lattamasi (AmpC) Pseudomonas aeruginosa cromosoma Spazio periplasmico La produzione di AmpC è inducibile Perché la resistenza si manifesti è necessario che un antibiotico β-lattamico induca la trascrizione del gene e sia allo stesso tempo un substrato per il prodotto
19 In un sistema in vitro AmpC Ampicillina Cefalosporine Carbenicillina Piperacillina Ceftazidime DA QUESTI DATI, CI SI ASPETTEREBBE SENSIBILITA SOLO NEI CONFRONTI DEI CARBAPENEMI Carbapenemi
20 ma in vivo... Ampicillina Cefalosporine Carbenicillina Piperacillina Ceftazidime Carbapenemi Sono riconosciuti come induttori e degradati da AmpC Sarebbero degradati da AmpC che però non viene prodotta perché queste molecole NON sono riconosciute come induttori Sono riconosciuti come induttori, AmpC È prodotta ma è inefficace su queste molecole
21 MODIFICAZIONI DEL BERSAGLIO IL BERSAGLIO PUO ESSERE ASSENTE I MICOPLASMI, CHE NON HANNO PARETE, SONO INTRINSECAMENTE RESISTENTI AI β-lattamici
22 IL BERSAGLIO PUO ESSERE NATURALMENTE INSENSIBILE RESISTENZA INTRINSECA ALLE RIFAMICINE NEI MICOPLASMI Core enzima σ RESISTENZA INTRINSECA ALLE CEFALOSPORINE NEGLI ENTEROCOCCHI Le PBP degli enterococchi sono strutturate in modo da non essere legate dalle CEFALOSPORINE
23 IL BERSAGLIO PUO MODIFICARSI PER MUTAZIONE * Gene Bersaglio modificato Resistenza acquisita a: gyra DNA girasi (sub.a) Chinoloni parc Topoisomerasi IV Chinoloni rpob RNA polimerasi (sub β) Rifampicina IL BERSAGLIO PUO VENIRE MODIFICATO BIOCHIMICAMENTE
24 CH 3 Alcuni microrganismi metilano il proprio rrna, rendendolo così meno affine nei confronti di Macrolidi e Lincosamidi I ceppi VRE (Vancomycin-Resistant-Enterococci) Sintetizzano un dipeptide D-alanil-D-lattato Eliminando le normali terminazioni D-ala-D-ala I nuovi dipeptidi non sono riconosciuti dalla vancomicina
25 UN ALTRA PROTEZIONE DEL RIBOSOMA PUO ESSERE OTTENUTA GRAZIE A UN INGOMBRO STERICO In un altro caso il ribosoma viene protetto da una proteina, Che lo rende inaccessibile alle tetracicline
26 UN ALTRA POSSIBILITÀ È QUELLA DI ALLONTANARE L ANTIBIOTICO PRIMA CHE FACCIA DANNI E quello che i microrganismi ottengono con le pompe di efflusso LE POMPE DI EFFLUSSO TRANSMEMBRANA Perché un antibiotico sia efficace, la sua concentrazione all interno della cellula batterica deve essere sufficiente a inattivare il bersaglio I batteri sintetizzano proteine che hanno la funzione di espellere attivamente la molecola di antibiotico.. Le pompe di efflusso impediscono alla concentrazione intracellulare di risultare efficace
27 ESISTONO DIVERSI TIPI DI POMPE DI EFFLUSSO Membrana plasmatica Alcune sono specifiche.. Citoplasma Tetracicline (Gram+ e Gram-) Macrolidi (streptococchi stafilococchi) Disinfettanti e Intercalanti (Gram+ e Gram-) Chinoloni (streptococchi)..altre non lo sono (Sistemi di efflusso multidrug)
28 IMPEDIRE ALL ANTIBIOTICO DI RAGGIUNGERE IL BERSAGLIO E UN ALTRA STRATEGIA POSSIBILE Resistenza intrinseca ai GLICOPEPTIDI nei batteri Gram-negativi IMPERMEABILITA DELLA PARETE Resistenza intrinseca ai MACROLIDI in molti batteri Gram-negativi Resistenza intrinseca a molti farmaci nei micobatteri
29 L impermeabilita della parete puo anche essere dovuta ad una mutazione Pseudomonas aeruginosa carbapenemi La porina D2 rappresenta il canale di ingresso per i carbapenemi??? carbapenemi In seguito a mutazione la cellula può perdere la capacità di produrre la porina D2 Resistenza acquisita ai carbapenemi
30 I VACCINI PROCESSO DI IMMUNIZZAZIONE ATTIVA L OSPITE PRODUCE ANTICORPI CONTRO L ANTIGENE SOMMINISTRATO PREVENZIONE DELL INFEZIONE A SEGUITO DI SUCCESSIVE ESPOSIZIONI ALL AGENTE PATOGENO OGGETTO DELLA VACCINAZIONE I SIERI IMMUNI: PROCESSO DI IMMUNIZZAZIONE PASSIVA: SOMMINISTRAZIONE DI ANTICORPI PREFORMATI
31 1) Vaccini interi uccisi: influenza, Salk, epatite A, rabbia, pertosse intero 2) Vaccini vivi attenuati: BCG, MPR, Sabin, febbre gialla, varicella, Ty21a 3) Vaccini con componenti purificati: influenza a sub-unità o split, pertosse acellulare, anatossina difterica e tetanica, vaccini coniugati (Hib, pneumococco e meningococco) 4) Vaccini coniugati (Haemophilus influenzae tipo b, meningococco, pneumococco): polisaccaridi coniugati con proteine carrier che li rendono maggiormente immunogeni e aumentano il coinvolgimento dei linfociti T 5) Reverse vaccinology: studio del genoma, individuazione dei possibili antigeni meningococco gruppo B 6) Vaccini DNA ricombinanti: es. HBsAg 7) Vaccini a DNA: contro tutti gli agenti infettivi; non ancora in commercio 8) Vaccini da piante, geneticamente modificate
32 TECNICHE TRADIZIONALI Colture batteriche inattivate rabbia amplificazione su animali vaiolo amplificazione su uova (es. Virus influenzale) e inattivazione
33 LIMITI DEI VACCINI TRADIZIONALI Non tutti i patogeni possono essere coltivati Problemi di sicurezza per il personale di laboratorio Costi elevati Attenuazione insufficiente Ritorno allo stato infettivo Necessità di conservazione in luoghi refrigerati Non disponibile per tutti i patogeni
34 VACCINI RICOMBINANTI A SUB-UNITA Clonazione in batteri o lieviti del gene che codifica l immunogeno più rappresentato Antibatterici: proteine di adesione o tossine modificate Antivirali: una proteina del capside o dell envelope es.: HBsAg ANTIGENE DELL ENVELOPE DI HBV Ottenuto in lievito PURIFICAZIONE
35 HBsAg ANTIGENE DELL ENVELOPE DI HBV E la molecola di scelta per allestire il vaccino clonandola nell ospite SACCHAROMYCES Proteina di superficie HBs L antigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa
36 NON si usano virus o batteri interi, ma solo componenti Vantaggi: non si somministrano altre molecole del patogeno Svantaggi: La proteina manterrà la conformazione naturale? costi
37 VACCINI ATTIVI RICOMBINANTI OMOLOGHI: mutanti di specie patogene (delezione/mutazione dei geni di virulenza) Vantaggio: la delezione dei geni di virulenza non permette la reversione allo stato virulento Più efficaci dei vaccini uccisi e di quelli a subunità (proteine) Es: Produzione di PTX inattiva da parte di B.pertussis Allo studio: Virus Erpetico dopo delezione del gene TK che ne causa la virulenza Vibrio Cholerae : Il vaccino disponibile è a base di batteri uccisi col fenolo e l immunità non dura più di 3-6- mesi
38 VACCINI ATTIVI RICOMBINANTI ETEROLOGHI: clonazione in virus o batteri, geneticamente modificati usati come vettori VIRUS Es virus del vaiolo bovino: vettore per vaccini ricombinanti, tra cui alcuni sperimentali anti-hiv
39 Il vaccinia virus si replica direttamente nel citoplasma, non è patogeno e il suo genoma è stato sequenziato Queste caratteristiche ne fanno un buon candidato per portare determinanti antigenici di patogeni Diversi antigeni sono stati inseriti nel genoma del virus del vaccino: Proteina G (virus della rabbia) Antigene superficiale di HBV proteine NP e HA del virus influenzale Un vaccino ricombinante per la rabbia nel virus vaccinale, è in grado di immunizzare le volpi che sono i principali portatori della malattia
40 MUTANTI DI BATTERI INVASIVI Mutanti di Salmonella enterica sono stati usati per lo sviluppo di un nuovo vaccino anti-hbv Anche batteri non invasivi ma del tutto sicuri (LAB) sono stati studiati come vettori
41 VACCINI A DNA Lo scopo di un vaccino a DNA è promuovere la sintesi dell antigene direttamente all interno di una cellula Mimando quello che succede nelle infezioni virali
42 Le cellule Dendritiche sono critiche in questo processo vaccini uccisi o attenuati: gli antigeni penetrano dall esterno Seguono la via endolisosomiale; sono degradati II E i loro frammenti sono presentati su MHC-II
43 l informazione inserita direttamente nella cellula, invece Raggiunge il nucleo È trascritta L antigene è prodotto nel citoplasma e segue due vie: I Esce dalla cellula E tagliato e presentato su MHC-I S.I. come i vaccini tradizionali Attiva i CD8 CD8
44 La forma di rilascio nella cellula è su di un plasmide Il gene deve essere sotto un promotore eucariotico La somministrazione può avvenire per via INTRADERMICA INTRAMUSCOLARE Queste vie di somministrazione hanno l effetto di incrementare l intercettazione dell antigene da parte delle cellule dendritiche
45 INTRADERMICA Gene gun Inoculazione seguita da un trattamento con il laser Il trattamento con il Laser aumenta il tasso di ingresso nelle cellule dendritiche
46 Il Gene gun è un dispostivo che spara particelle d oro ricoperte con l antigene Portacartucce Cartuccia per le particelle ELIO Particelle d oro ricoperte di DNA Canale di accelerazion e Le particelle entrano così in contatto direttamente con DC immature situate subito sotto la pelle (cellule di Langerhans)
47 All interno di microparticelle INOCULAZIONE INTRAMUSCOLARE come DNA nudo seguita da un trattamento di elettroporazione Il trattamento di elettroporazione aumenta la permeabilità delle DC al vaccino Le particelle favoriscono l uptake
48 E STATO ANCHE PROPOSTO UN RILASCIO ALTERNATIVO AI PLASMIDI CLONARE IL GENE NEL GENOMA DI UN BATTERIOFAGO AMPLIFICARE IL FAGO INOCULARE IL FAGO PURIFICATO LE CELLULE APC CATTURANO IL BATTERIOFAGO IL CAPSIDE E DEGRADATO L INFORMAZIONE E RILASCIATA NEL CITOPLASMA..
49 I VANTAGGI DEI VACCINI A DNA SONO MOLTI STABILITA PRODUZIONE SEMPLICE ED ECONOMICA FACILITA DI MANIPOLAZIONE DELL ANTIGENE (SEGUIRE LE MUTAZIONI DEL PATOGENO) SINTESI PROTEICA DIRETTA DA PARTE DELL OSPITE STIMOLAZIONE PROLUNGATA DEL S.I.
50 LE PREVISIONI SUL FUTURO DEI VACCINI: Uccisi 2000 Attenuati prime boost (vaccino a DNA + richiamo successivo con antigene proteico o microrganismo inattivato) a DNA 2020 Immunoterapia Per mezzo di vettori che non si replicano Mucosale Attraverso reverse vaccinology A subunità
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