Università degli Studi di Padova

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1 Università degli Studi di Padova Facoltà di Farmacia Sviluppo e applicazione di metodiche per il dosaggio plasmatico degli antibiotici linezolid e vancomicina mediante HPLC di Rita Briani Relatore: Ignazio Castagliuolo A. A

2 2. INTRODUZIONE 2.1 Classi di farmaci antibatterici. Gli antibiotici sono metaboliti prodotti da microorganismi che, a piccole dosi, inibiscono la crescita (batteriostatici) e la sopravvivenza (battericidi) di altri microorganismi senza causare eccessiva tossicità nell organismo ospite. Oltre agli antibiotici veri e propri, molecole di origine naturale, si sono andati sviluppando negli anni composti di origine sintetica. Un tempo si impiegava la distinzione fra antibiotici a spettro limitato e ad ampio spettro, ma in seguito alla comparsa di ceppi batterici resistenti ad un farmaco o a più di uno, è ora preferibile una classificazione in base al sito bersaglio nella cellula ospite. Si distinguono quattro principali classi di farmaci antibatterici, gli inibitori della sintesi della parete cellulare, gli inibitori della sintesi proteica, gli inibitori della sintesi degli acidi nucleici e gli antimetaboliti. Di seguito riporto una breve descrizione di queste classi di farmaci, con i principali composti che vi appartengono, il meccanismo d azione e lo spettro di attività. 2.1.a Inibitori della sintesi della parete cellulare. L interferenza con la sintesi della parete batterica è di gran lunga il meccanismo di azione più comune nell ambito dell attività degli antibiotici. Il primo gruppo di antibiotici classificato tra gli inibitori della sintesi della parete cellulare è quello dei β-lattamici. La principale componente strutturale della parete delle cellule batteriche è lo strato di peptidoglicano. E costituito da catene di residui disaccaridici formati da molecole alternate di N-acetilglucosammina ed acido N-acetilmuramico. Queste catene sono legate da ponti peptidici in grado di creare un rivestimento rigido che avvolge il batterio e la formazione sia delle catene che dei legami crociati è catalizzata da enzimi regolatori specifici (es. transpeptidasi, carbossipeptidasi, endopeptidasi) detti proteine leganti la penicillina (PBP) in quanto si legano covalentemente agli antibiotici β-lattamici. Quando i batteri in attiva replicazione sono esposti a questi antibiotici, l antibiotico si lega a specifiche PBP presenti sulla membrana citoplasmatica del batterio, inibendo la formazione dei legami crociati e portando di conseguenza all attivazione di autolisine che degradano la parete cellulare causando la morte per lisi della cellula batterica. Al gruppo degli antibiotici β-lattamici appartengono le penicilline, le cefalosporine e cefamicine, i carbapenemi e i monobattamici. Le penicilline sono antibiotici molto efficaci, con una tossicità estremamente bassa. Il composto base è un acido organico con un anello β-lattamico ottenuto dalla coltura della muffa Penicillium chrysogenum. Se la muffa cresce con un processo di fermentazione vengono prodotte grandi quantità di un intermedio chiave, l acido 6-amminopenicillamico in cui l anello β-lattamico è fuso con l anello tiazolinico. La sostituzione chimica di questo intermedio produce derivati che hanno minore sensibilità agli acidi e presentano maggiore assorbimento nel tratto gastrointestinale, maggiore resistenza alla distruzione da parte della penicillinasi come meticillina e oxacillina, o un più ampio spettro di attività nei confronti dei batteri gram-negativi come ampicillina, carbenicillina, ticarcillina, piperacillina. Nelle cefalosporine l anello β-lattamico è fuso con un anello diidrotiazinico, mentre le cefamicine contengono ossigeno al posto dello zolfo nell anello diidrotiazinico. Presentano entrambe lo stesso meccanismo d azione delle penicilline, ma un più ampio spettro antibatterico, resistenza a molte β-lattamasi e migliori proprietà farmacocinetiche. Sfortunatamente i batteri gram-negativi 5

3 hanno sviluppato rapidamente una resistenza a cefalosporine e cefamicine, che ha compromesso l uso di questi farmaci. I carbapenemi sono antibiotici ad ampio spettro, mentre i monobattamici sono a spettro ristretto (attivi solo contro batteri gram-negativi aerobi); tuttavia, nonostante il vantaggio di non distruggere la normale flora batterica intestinale del paziente, questi ultimi sono scarsamente utilizzati. Nel gruppo dei polipeptidi troviamo la bacitracina e le polimixine. La bacitracina, isolata da Bacillus licheniformis, è una miscela di polipeptidi utilizzata in prodotti per uso topico (creme, unguenti, spray) per il trattamento di infezioni della pelle causate da batteri gram-positivi, mentre i batteri gram-negativi presentano resistenza. Essa inibisce la sintesi della parete cellulare interferendo con la defosforilazione e il riciclaggio del lipide trasportatore responsabile del passaggio dei precursori del peptidoglicano dalla membrana citoplasmatica batterica alla parete cellulare. Può anche danneggiare la membrana citoplasmatica ed inibire la trascrizione dell RNA. Le polimixine sono un gruppo di polipeptidi ciclici derivati da Bacillus polymyxa. Si inseriscono nelle membrane batteriche ed interagiscono con i lipopolisaccaridi e con i fosfolipidi della membrana esterna, causando un aumento di permeabilità cellulare. Possono causare gravi problemi di nefrotossicità e sono impiegate nel trattamento di infezioni localizzate, in particolare quelle provocate da bacilli gram-negativi, poiché i batteri gram-positivi non presentano una membrana esterna e quindi non sono sensibili a questi antibiotici. Vi è poi un gruppo di antibiotici attivi sulla parete cellulare utilizzati per il trattamento di infezioni da micobatteri, comprendente isoniazide, etionamide, etambutolo e cicloserina. L isoniazide (idrazide dell acido isonicotinico [INH]) è battericida sui micobatteri che si replicano attivamente, andando ad influenzare la sintesi dell acido micolico. Anche l etionamide, un derivato di INH, blocca la sintesi degli acidi micolici. L etambutolo interferisce con la sintesi dell arabinogalattano presente nella parete, mentre la cicloserina inibisce due enzimi, la D-alanina D-alanina sintetasi e l alanina racemasi, che intervengono nella sintesi della parete. La classe di antibiotici inibitori della sintesi della parete cellulare comprende anche il gruppo dei glicopeptidi, antibiotici battericidi che inibiscono la formazione della parete batterica, interferendo con la polimerizzazione del peptidoglicano. Questi antibiotici vengono utilizzati nelle gravi infezioni da batteri resistenti ai β-lattamici, contro cocchi e bacilli gram-positivi, in quanto i gram-negativi sono naturalmente resistenti. A questo gruppo appartengono gli antibiotici vancomicina e teicoplanina, molecole di elevato peso molecolare, che non riescono quindi ad attraversare la membrana cellulare esterna dei gram-negativi. In particolare, per la vancomicina, oggetto di studio del mio lavoro di tesi, descriverò le principali caratteristiche e proprietà in modo più approfondito in un paragrafo successivo. 2.1.b Inibitori della sintesi proteica. La principale azione di questi farmaci, che appartengono alla seconda più vasta classe di antibiotici, è l inibizione della sintesi proteica. Fanno parte di questa classe amminoglicosidi, tetracicline, cloramfenicolo, macrolidi, clindamicina, streptogramine ed oxazolidinoni. Gli antibiotici amminoglicosidici sono composti da amminozuccheri legati da legami glicosidici ad un anello di amminociclitolo. Riescono a penetrare la membrana esterna dei gram-negativi, la parete cellulare e la membrana cellulare, e nel citoplasma inibiscono la sintesi batterica, legandosi irreversibilmente alle proteine della subunità 30S dei ribosomi ed esplicando così un azione battericida. Sono utilizzati per trattare infezioni gravi provocate da batteri gram-negativi e da alcuni gram-positivi. Gli streptococchi e gli enterococchi sono resistenti agli amminoglicosidi perché tali antibiotici non riescono ad 6

4 attraversare la parete cellulare di questi batteri. I composti più comunemente utilizzati sono l amikacina, la gentamicina e la tobramicina, impiegati tutti e tre nel trattamento delle infezioni sistemiche da batteri gramnegativi sensibili. L amikacina è impiegata per trattare infezioni da gram-negativi resistenti alla gentamicina e alla tobramicina. Le tetracicline sono antibiotici batteriostatici ad ampio spettro che inibiscono la sintesi proteica nei batteri, bloccando il legame dell amminoacil-rna transfer (trna) al complesso subunità ribosomiale 30S-mRNA. Tetraciclina, doxicillina e minociclina sono efficaci nel trattamento di infezioni provocate da Mycoplasma, Rickettsia e altri batteri gram-positivi e gram-negativi. Tutte hanno uno spettro di attività simile, mentre doxiciclina e minocillina hanno diverse proprietà farmacocinetiche, in quanto vengono più facilmente assorbite e mostrano una più lunga emivita. Il cloramfenicolo possiede ampio spettro antibatterico, ma è poco utilizzato perché, oltre ad inibire la sintesi proteica batterica, interferisce con la sintesi proteica delle cellule umane del midollo osseo. Esercita il proprio effetto batteriostatico legandosi alla componente peptidiltransferasica della subunità ribosomiale 50S, bloccando così l allungamento del peptide. Il composto di riferimento dei macrolidi è l eritromicina, prodotta dallo Streptomyces erythreus. La struttura base di questa classe di antibiotici è un lattone macrociclico legato a due zuccheri, desosammina e cladinosio. Agiscono legandosi reversibilmente all RNA 23S della subunità ribosomiale 50S, bloccando l allungamento del polipeptide. Sono antibiotici ad ampio spettro di attività, utilizzati nel trattamento di infezioni polmonari provocate da Mycoplasma, Legionella e Clamydia, e da batteri gram-positivi in pazienti allergici alla penicillina. La maggior parte dei batteri gram-negativi è resistente ai macrolidi. La clindamicina fu isolata dallo Streptomyces lincolnensis. Come il cloramfenicolo e i macrolidi, blocca l allungamento della catena proteica legando la subunità ribosomiale 50S. Inibisce la peptidiltransferasi interferendo con il legame del complesso amminoacido-acil-trna. E attiva sugli stafilococchi e sui bacilli gram-negativi anaerobi, ma è generalmente inattiva sui batteri gram-negativi aerobi. Le streptogramine sono una classe di peptidi ciclici prodotti da specie del genere Streptomyces. Attualmente è disponibile in terapia il quinupristin-dalfopristin (nome commerciale Synercid) costituito dalla combinazione dei due antibiotici quinupristina e dalfopristina. La dalfopristina si lega alla subunità ribosomiale 50S ed induce un cambiamento conformazionale che facilita il legame della quinupristina. La dalfopristina previene l allungamento della catena peptidica e la quinupristina favorisce il rilascio prematuro delle catene polipeptidiche dal ribosoma. L associazione dei farmaci è attiva contro stafilococchi, streptococchi ed E. faecium. Infine a questa classe di antibiotici appartengono gli oxazolidinoni, tra cui il linezolid, oggetto della mia tesi, di cui descriverò le caratteristiche principali e le proprietà in un paragrafo successivo. 2.1.c Inibitori della sintesi degli acidi nucleici. I principali composti di questa classe sono i chinoloni, rifampicina, rifabutina e metronidazolo. I chinoloni sono agenti chemioterapici di sintesi che inibiscono la DNA topoisomerasi batterica di tipo II (girasi) o la DNA topoisomerasi batterica di tipo IV, enzimi indispensabili per la replicazione, la ricombinazione e la riparazione del DNA. Nei batteri gram-negativi, la subunità A della girasi rappresenta il principale bersaglio dei chinoloni, mentre la topoisomerasi di tipo IV è il principale bersaglio nei batteri gram-positivi. L acido 7

5 nalidixico è stato il primo chinolone impiegato in terapia, ora sostituito da composti più attivi, come la ciprofloxacina, levofloxacina, gatifloxacina e moxifloxacina (fluorochinoloni), con eccellente attività sia sui gram-positivi che sui gram-negativi. La rifampicina, un derivato semisintetico della rifamicina B, prodotta dallo Streptomyces mediterranei, si lega all RNA polimerasi DNA-dipendente ed inibisce la sintesi dell RNA. E battericida per Mycobacterium tubercolosis ed è particolarmente attiva sui cocchi gram-positivi aerobi, inclusi gli stafilococchi e gli streptococchi, mentre i batteri gram-negativi sono intrinsecamente resistenti alla rifampicina. La rifabutina, derivata anche questa dalla rifamicina, possiede un meccanismo d azione simile alla rifampicina ed un analogo spettro di attività. Il metronidazolo è un farmaco che venne introdotto in origine per il trattamento per via orale delle vaginiti causate dal protozoo Trichomonas, ma è efficace anche nel trattamento di amebiasi, giardiasi e di gravi infezioni da batteri aerobi. Le sue proprietà antibatteriche derivano dalla riduzione del suo nitrogruppo da parte di nitroriduttasi batteriche, che producono composti citotossici in grado di distruggere il DNA batterico. 2.1.d Antimetaboliti. I sulfamidici sono antimetaboliti che competono con l acido p-amminobenzoico, impedendo la sintesi dell acido folico, elemento fondamentale per la crescita di molti microorganismi. Poiché i mammiferi non sintetizzano l acido folico, i sulfamidici non interferiscono con il metabolismo delle cellule umane. Sono efficaci contro un gran numero di batteri gram-positivi e gram-negativi, come Nocardia e Chlamydia e anche contro alcuni protozoi. Il trimethoprim interferisce con il metabolismo dell acido folico inibendo la diidrofolato reduttasi e impedendo la conversione di diidrofolato a tetraidrofolato. Blocca la formazione di timidina, di alcune purine, di metionina e di glicina. L associazione trimethoprim-sulfametossazolo è efficace contro un gran numero di gram-positivi e di gram-negativi ed è il farmaco di elezione per il trattamento di infezioni del tratto urinario sia acute che croniche. Agisce anche contro infezioni del tratto respiratorio inferiore, otite media e gonorrea. Vi sono infine il dapsone e l acido p-amminosalicilico, antifolati utili nel trattamento di infezioni da micobatteri. 2.2 Linezolid. Il linezolid (figura 2.1) è il primo composto di una nuova classe di farmaci antibatterici, gli oxazolidinoni, ad essere entrato in terapia intorno al Scoperti alla fine degli anni 80, fu in seguito abbandonata la ricerca su di essi, per essere poi ripresa agli inizi degli anni 90, con la sintesi di analoghi non tossici e con buona attività antibatterica. Figura 2.1. Struttura molecolare del linezolid (pk a = 1,8) 8

6 Gli oxazolidinoni legano la subunità 50S del ribosoma batterico, prevenendo la formazione del complesso con la subunità 30S, l mrna, i fattori di trascrizione e il formilmetionil-trna. Il risultato è il blocco della formazione del complesso di inizio della trascrizione per la sintesi proteica (Livermore, 2003). Questo meccanismo d azione è un po diverso da quello di altri composti inibitori della sintesi proteica come il cloramfenicolo, i macrolidi, le tetracicline, che agiscono impedendo l allungamento del peptide in formazione: per questo motivo difficilmente si verifica resistenza crociata (figura 2.2). Figura 2.2. Meccanismo d azione degli oxazolidinoni. Gli oxazolidinoni si combinano con la subunità ribosomiale 50S, prevenendo la formazione del complesso con la subunità 30S, l mrna, i fattori di trascrizione ed il formilmetionil-trna. Di conseguenza non si ha formazione di alcun complesso di inizio della trascrizione e la sintesi proteica è bloccata. Altri composti inibitori della sintesi proteica bloccano invece l allungamento del peptide (da Livermore, 2003). Il linezolid presenta attività batteriostatica, e in virtù del suo diverso meccanismo d azione, è attivo verso numerose specie di batteri gram-positivi, come streptococchi, stafilococchi ed enterococchi, che presentano resistenza nei confronti di altre terapie antibiotiche. Di notevole importanza è l attività verso infezioni provocate da ceppi di Staphylococcus aureus meticillina-resistenti (MRSA) e da enterococchi vancomicina-resistenti (VRE), quale Enterococcus faecium, infezioni della pelle e dei tessuti molli, i cui principali agenti eziologici sono Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes, polmoniti associate a batteriemie causate da Streptococcus pneumoniae sensibile alla penicillina, polmoniti nosocomiali, polmoniti acquisite in seguito a vita in comunità. E inoltre attivo verso Mycobacterium tubercolosis ed altre specie di micobatteri. La somministrazione di una dose da 600 mg ogni 12 ore permette di raggiungere e mantenere la concentrazione minima inibitoria (MIC) per l intera durata dell intervallo terapeutico. Lo steady-state viene raggiunto dopo due-quattro dosi, con una concentrazione plasmatica minima (C min ) intorno a 4 mg/l e una concentrazione plasmatica massima (C max ) di mg/l (Jungbluth et al., 2003), rimanendo quindi sempre al di sopra della MIC per i batteri sensibili al linezolid, compresa tra 0,5 e 4 mg/l (Livermore, 2003). Il linezolid viene rapidamente e completamente assorbito dopo somministrazione per via orale, raggiungendo la C max dopo 1-2 ore dalla somministrazione. Presenta biodisponibilità intorno al 100%, il che permette il passaggio 9