Microbiologia ANTIBIOTICI Antonio Nenna ANTIBIOTICI

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1 ANTIBIOTICI Un antibiotico è una molecola a basso PM, di produzione naturale, che agisce su batteri e non è tossica per l uomo (dotata di tossicità selettiva). La tossicità selettiva è il rapporto tra la dose che agisce sui batteri e la dose tossica. Se la dose efficace è minore della dose tossica, il farmaco ha tossicità selettiva. Ad inizio 900, Elrich pensò l esistenza di un magic bullet che uccide batteri e non le cellule umane, e trova una molecola contenente arsenico che agiva contro la sifilide. Negli anni 30, Fleming tentava di isolare gli Haemophilus influenzae, che crescono vicino agli Staphilococcus aureus (H. influenzae ha bisogno di due fattori contenuti nei globuli rossi, e l emolisina di S. aureus lisa i globuli rossi; quindi H. cresce vicino a S.). Lasciando aperta una piastra, trova che le colonie di s. erano scomparse, ed erano cresciute delle muffe dovute al fungo penicillum, il quale produceva una sostanza (la penicillina) che lisava gli Staphilococcus. Successivamente, il gruppo Bayer studiò l azione dei coloranti sui batteri (screening per vedere se coloranti sono tossici, poichè già si sapeva che la colorazione di Gram inibiva i batteri, ma era tossica per l uomo). Nel 1935, Domac scoprì il prontosil-rosso, una molecola sulfamidica; poco tossica per l uomo, non di produzione naturale (chemioterapico). Ai sulfamidici appartengono i chemioterapici tuttora utilizzati. I sulfamidici (metotrexate) causano interferenza sulla catena enzimatica della di-idro-pteroato-sintetasi (con inibizione della sintesi di ac. folico, che negli uomini è una vitamina e viene assunta preformata con la dieta, mentre nei batteri è un prodotto endogeno). La penicillina e i suoi derivati (famiglia dei beta-lattamici) ha il target specifico dei batteri (non c è target nell uomo), poichè interferisce solo i processi batterici di sintesi del peptidoglicano, agendo sulle PBP (penicillin binding protein). Per i gram-negativi, bisogna penetrare la membrana esterna, quindi essere lipofili: la penicillinag (scoperta da Fleming) non è attiva, poichè non passa la membrana esterna. Le penicilline agiscono solo sui batteri in moltiplicazione, che sintetizzano il peptidoglicano; quelli che non si duplicano non solo sensibili. Sono disponibili tre metodi per ottenere sostanze ad azione antibatterica: 1) cercare molecole naturali che fossero antibatteriche: penicillina, streptomicina 2) produrre analoghi artificiali per superare i difetti intrinseci. 3) trovare molecole che agiscono su target caratteristici dei batteri. Gli antibiotici si dividono in base al loro sito di azione: - antibiotici che agiscono sulla sintesi del peptidoglicano beta-lattamici (penicillina), glicopeptidi (vancomicina), antibiotici per batteri con acidi micoici (isoniazide, antitbc) - antibiotici che agiscono sul ribosoma batterico 30S [aminoglicosidi (gentamicina, streptomicina), tetracicline, linezolide] 50S [cloramfenicolo, macrolidi, clindamicina] - antibiotici che agiscono sulla RNApol batterica rifampicina, antitbc [mutazioni puntiformi della RNApol causano resistenza, non va utilizzata mai da sola] - antibiotici che agiscono sulla DNApol batterica chinolonici (ciprofloxacina e levofloxacina) [agiscono sulle topoisomerasi batteriche] - antibiotici antimetaboliti sulfamidici [agiscono su enzimi per la sintesi di folati]

2 ANTIBIOGRAMMA L antibiogramma permette di trovare gli antibiotici per il trattamento di uno specifico batterio: - diluizione in brodo: diluisco l antibiotico con rapporti successivi 1:2 e aggiungo una quantità fissa di brodo batterico. es. 512 μg/ml, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.12 alcune colture mi rimangono torbide (sono quelle dove il batterio è presente, quindi l antibiotico non è sufficiente). La provetta non torbida con la massima diluizione indica la MIC (minima concentrazione inibente). Per trovare la MBC (minima dose battericida) [ovvero la dose minima che inibisce la crescita del 99,9% dei batteri] prelevo i campioni e li semino in agar: - se tra MIC e MBC ci sono meno di due diluizioni di differenza, l antibiotico è battericida - se tra MIC e MBC ci sono più di due diluizioni di differenza, l antibiotico è batteriostatico La MIC è correlata con i parametri di terapia per il paziente, e nell antibiogramma viene detto se il batterio è sensibile o resistente ad un antibiotico. L antibiotico può agire in maniera: - tempo-dipendente: tempo in cui la concentrazione ematica è superiore alla MIC (tempo di azione del farmaco maggiore della MIC) (quale antibiotico è al di sopra della MIC per il maggior tempo possibile) (l antibiotico che dura di meno lo dovrei somministrare più volte per avere l effetto dell antibiotico che dura più a lungo) [beta-lattamici] - concentrazione-dipendente: il picco di concentrazione ematica è superiore alla MIC (picco di azione del farmaco è maggiore della MIC) [aminoglicosidici, hanno attività post-antibiotica: dopo che hanno agito, anche se eliminassi i batteri, questi verrebbero comunque uccisi] [invece di dosare il valore di picco, misuro l integrale della curva, e trovo il rapporto tra area sotto la curva e la MIC] - diffusione in agar: semina dei batteri su agar con dei dischetti; intorno ai dischetti si genera un area di inibizione della crescita; si correla la MIC ottenuta con il brodo e il diametro dell inibizione, per trovare la sensibilità. Gli antibiotici ad ampio spettro agiscono sia su gram-positivi che su gram-negativi. meglio non usarli perchè elimina batteri normalmente presenti (permettendo la moltiplicazione del c. difficile) e causano ceppi resistenti. La resistenza antibiotica è data da: - modifica dell antibiotico (beta-lattamasi per beta-lattamici, enzimi acetilanti per aminoglicosidi) - modifica del target (modifiche di 23S o proteine ribosomiali per macrolidi) - pompe di efflusso (tetracicline, macrolidi)

3 BETA-LATTAMICI: si legano alle PBP. Sono formate da un anello a quattro atomi con un azoto e un gruppo chetonico; c è un secondo anello contenente solfo o ossigeno. Si distinguono in penicilline, carbapenemici (secondo anello con cinque atomi di carbonio e doppio legame) e cefemici (cefalosporine, secondo anello con sei atomi di carbonio). Altri farmaci, utilizzati in contemporanea con i beta-lattamici, si legano agli enzimi che tagliano l anello beta-lattamico (betalattamasi), nei batteri resistenti (s. aureus). la resistenza ai beta-lattamici mediata da betalattamasi è sempre esistita, oltre la prassi medica. Alcune penicilline agiscono anche sui gramnegativi (ampicillina, piperacillina) e vengono chiamate penicilline ad ampio spettro. La tossicità delle penicilline non è dovuta al meccanismo di azione (visto che sono dirette solo ai componenti batterici), ma può esserci allergia. Transpeptidasi e beta-lattamasi hanno una serina al sito attivo ed entrambe si legano all anello beta-lattamico; il beta lattamico inibisce l azione della transpeptidasi oppure la beta-lattamasi apre l anello beta-lattamico, distruggendo l attività antibatterica. INIBITORI DELLA SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

4 Per impedire l azione antibatterica, il batterio può: - modificare l antibiotico (beta-lattamasi) - modificare il target dell antibiotico (meticillino-resistenza in s. aureus, MRSA per acquisizione di isola genetica che codifica per una transpeptidasi modificata, invece di PBP2 è PBP2a e non possiede la serina al sito attivo necessaria per il legame del beta-lattamico) Il problema della penicillina, visto che è una molecola idrofila, era la penetrazione attraverso la membrana esterna per entrare nei gram-negativi e bloccare la sintesi del peptidoglicano; furono sintetizzate penicilline che avevano parti idrofobe e con sostituzioni che impedissero l azione della beta-lattamasi. Negli stafilococchi ci sono quattro PBP; la penicillina causa una diminuzione del cross-linking del peptidoglicano (diminuisce l azione delle transpeptidasi); inoltre scompare il sistema di splitting (murosomi e vescicole che permettono la divisione batterica). In presenza di penicillina, il batterio può continuare a dividersi, ma poi muore (morte nascosta) per l attivazione delle idrolasi batteriche (autolisine). La penicillina quindi agisce solo sui batteri in moltiplicazione attiva, poichè solo li si ha la localizzazione del macchinario e l esposizione delle PBP sensibili alla penicillina (le PBP si producono solo quando il batterio si riproduce; la penicillina blocca la replicazione del peptidoglicano e il batterio scoppia). CEFALOSPORINE: l anello beta-lattamico è analogo; nelle penicilline il secondo anello ha 5 C e una catena modificabile, mentre nelle cefalosporine il secondo anello ha 6 C e due catene modificabili (R1 e R2). Sono dotate di lipofilicità (entrano nei gram-negativi) e protezione dalle beta-lattamasi. Agiscono come transpeptidasi e da transglicosilasi INIBITORI DELLA SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI su RNA: rifampicina su DNA: chinolonici (ciprofloxacina, levofloxacina e moxifloxacina), metronidazolo La resistenza ai chinolonici è dovuta all ampio uso negli anni passati, che ha selezionato ceppi resistenti. La rifampicina agisce sul bacillus tuberculosis (isolinazide + rifampicina + pirazina). I chinolonici agiscono sulle topoisomerasi, su gram-positivi e gram-negativi, a livello intracellulare.

5 INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA A differenza delle penicilline, negli inibitori della sintesi proteica c è tossicità legata al meccanismo di azione (cloramfenicolo, sul 50S, 1/40,000 somministrazioni può essere letale per il paziente, poichè causa anemia aplastica, irreversibile); inoltre, è presente anche tossicità per l endotelio. Gli antibiotici utilizzano come bersaglio selettivo una delle due subunità ribosomiali: 30S: aminoglicosidi (streptomicina, gentamicina, amicacina, tobramicina), tetracicline (glicil-glicina) 50S: macrolidi (eritromicina, azitromicina, claritromicina), streptogramina, clindamicina Questi antibiotici non sono battericidi, tranne gli aminoglicosidi (inibizione del 30S e produzione di ROS). I battericidi quindi sono: beta-lattamici (tempo dipendenti) e amminoglicosidi (concentrazione dipendenti), e agiscono su gram-positivi e gram-negativi. La resistenza agli aminoglicosidi è la modifica dell antibiotico, tramite trasposoni e plasmidi, che producono enzimi che acetilano o fosforilano gli antibiotici. MACROLIDI: penetrano facilmente nelle cellule eucariotiche, e possono agire nei batteri intracellulari (polmonite da mycoplasma, legionella). La resistenza ai macrolidi è dovuta a modifiche del target (non a inattivazione, come per la beta-lattamasi sui beta-lattamici): - nel 30S, la modifica è sul 16S rrna - nel 50S, la modifica è sul 23S rrna - modifiche in proteine del ribosoma (dimetilazione di adenina-2058) ANTIBIOTICI ANTIMETABOLITI Gli antimetaboliti sono antibiotici batteriostatici che inibiscono la sintesi dei folati tramite inibizione di: - diidropteroato-sintetasi - diidropteroato-reduttasi Nell uomo, l ac. folico è una vitamina, e non viene sintetizzata. Pertanto sono specifici per i batteri.