Le cellule dell immunità innata riconoscono alcune molecole espresse e/o prodotte dai patogeni dette PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) e

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2 Identificazione dei patogeni o del self dannegiato Le cellule dell immunità innata riconoscono alcune molecole espresse e/o prodotte dai patogeni dette PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) e molecole endogene prodotte o rilasciate dalle cellule danneggiate DAMP (Damage -Associated Molecular Patterns) tramite alcuni recettori, detti PRR (Pattern Recognition Receptor) 2

3 ESEMPI DI PAMP E DAMP Profili molecolari associati ai patogeni : Acidi nucleici (virus, batteri) Proteine (batteri) Lipidi di parete (batteri) Carboidrati batterici e fungini Profili molecolari associati al danno cellulare: Proteine dello stress (HSP) Proteine nucleari (HMGB1) 3

4 Pattern Recognition Receptors (PRR) I PRR possono essere suddivisi in base alla diversa espressione, localizzazione e funzione: PRR Espressi sulla superficie o all interno della cellula PRR Solubili 4

5 PRR Espressi sulla superficie o all interno della cellula di membrana Toll-like receptor (TLRs) Recettori per il mannosio Recettori scavenger endosomiali Toll-like receptor (TLRs) citoplasmatici NOD-like receptor (NLRs) RIG-I-like receptor (RLR, CARD family) NOD: dominio di oligomerizzazione legante il nucleotide RIG: retinoic-acid-inducible gene I (RNA helicase) 5

6 I sensori cellulari del pericolo sono posizionati in maniera strategica 6

7 PRR di membrana e endosomiali 7

8 TOLL-LIKE LIKE RECEPTORS 8

9 Toll-like like Receptors (TLRs) I TLRs sono una famiglia di PRR conservatasi nell evoluzione e sono espressi da diverse cellule importanti per le risposte innate contro i patogeni Scoperti nella Drosophila 11 nell uomo Ricoscono vari PAMPs -lipopolisaccaride (LPS) della parete dei batteri Gram- negativi -peptidoglicano della parete dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi -zymosan, flagellina -RNA virale a doppio filamento -DNA batterico e virale ricco di motivi CpG non metilati 9

10 Componenti della parete batterica polimeri di alcoli polivalenti Batteri gram-negativi Batteri gram-positivi Peptidoglicano: N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico 10

11 Drosophila Premio Nobel 1995 Christiane Nuesslein-Volhard identificò nell embrione delladrosophila una proteina che chiamò Toll (1985) Premio Nobel 2011 Jules Hoffman nel 1996 studiando i moscerini con una mutazione nel gene Toll, scoprì che erano incapaci di risposta immunitaria efficiente; concluse che il gene era coinvolto nel riconoscimento dei microrganismi dannosi e che la sua attivazione era necessaria al sistema immunitario. 11

12 Toll-like receptor: Molecular Structure IL-1 receptor family Toll like receptor family Ig-like domain LRRs Cysteine Toll-like receptor has an extracellular region which contains leucine rich repeats motifs (LRRs) and region rich in cysteine Box 1 Box 2 Box 3 TIR Domain Toll-like receptor has a cytoplasmatic tail which contains a Toll interleukin-1 (IL-1) Receptor (TIR) domain 12

13 Localizzazione dei Toll-like like Receptors (TLRs) 13

14 Toll-Like Receptors e i loro ligandi Receptor TLR1 Ligand (PAMPs) Triacyl lipopeptides Soluble factors Origin of Ligand Bacteria and Mycobacteria Neisseria meningitidis TLR2 Heat Shock protein 70 Peptidoglycan Lipoprotein/lipopeptides HCV core and nonstructural 3 protein Host Gram-positive bacteria Various pathogens Hepatitis C Virus TLR3 Double-stranded RNA Viruses TLR4 Lipopolysaccharides (LPS) Envelope protein Taxol Gram-negative bacteria Mouse mammary-tumor virus Plants TLR5 Flagellin Bacteria TLR6 Zymosan Lipoteichoic acid Diacyl lipopetides Fungi Gram-positive bacteria Mycoplasma TLR7 Single-stranded RNA (ssrna ssrna) Imidazoquinoline Viruses Synthetic compounds TLR8 Single-stranded RNA (ssrna ssrna) Imidazoquinoline Viruses Synthetic compounds TLR9 CpG-containing DNA Bacteria, Malaria and Viruses TLR10 Not determined Not Determined TLR11 Profilin-like like molecule Toxoplasma gondii 14

15 Proteine accessorie per il TLR-4 Il legame del LPS al TLR-4 espresso dai macrofagi è mediato dal CD14 e da MD-2 ed è potenziato dal LBP, una proteina che lega l LPS 15

16 Funzione dei Toll-like like Receptors (TLR) Il legame dei recettori TRL con i vari PAMP innesca: L attivazione dei fattori di trascrizione NFκB e AP-1 che portano alla: produzione di chemochine e citochine infiammatorie (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18) espressione di molecole co-stimolatrici (CD80, CD86) sulle cellule presentanti l Ag (APC) con conseguente attivazione dell immunità acquisita Molecole d adesione cellulare (E-selectina) L attivazione del fattore di trascrizione porta alla: produzione di INF α/β IRF-3/7 che 16

17 Toll-like receptors ed immunità acquisita 17

18 TLR: Meccanismi essenziali della trasduzione del segnale 18

19 PRR espressi sulla membrana che legano alcuni componenti batterici Il recettore per il Mannosio Presente su tutti i fagociti riconosce i residui di mannosio e di fruttosio (batteri) e dei glucani (funghi) I recettori Scavenger Presente su tutti i fagociti riconoscono alcuni polimeri anioni e lipoproteine acetilate a bassa 19 densità 19

20 PRR citoplasmatici 20

21 NOD-like receptor (NLRs) 21

22 I NLR riconoscono i PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) e i DAMPs (danger associated molecular patterns). I NLRs comprendono 22 geni umani divisi in distinte sottofamiglie come i NOD e i NLP Questi PRR si assemblano in complessi ad alto peso molecolare detti Inflammasomi 22

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24 L INFLAMMOSOMA: ruolo Citochine infiammatorie come IL-1β sono sintetizzate come zimogeni inattivi La loro attività è controllata mediante l attivazione proteolitica. La proteolisi avviene ad opera delle caspasi infiammatorie, come le caspasi-1, 4 e 5. Queste caspasi, in particolare la 1 si attivano nella piattaforma molecolare costituita dall inflammosoma e trasformano la pro-il-1β e pro-il-18 in IL-1β e IL-18 24

25 Struttura dei NOD N-term CARD NBD LRRs C-term LRRs (Leucine-Rich Repeats) NBD (Nucleotide binding Domain) CARD (Caspase-activating activating and recruitment domain) 3 DOMINI: Funzione LRR --> riconoscimento ligando NBD-> oligomerizzazione CARD--> reclutamento e attivazione 25

26 NOD ligands: molecules produced during synthesis and/or degradation of peptidoglycan NOD1. dipeptide-γ-d-glutamyl-meso-diaminopimelic acid (DAP), gram-negative NOD2: muramyl dipeptide (MDP); gram-negative e gram-positive MDP Meso-DAP 26

27 NOD-2 and Crohn s disease 27

28 Cosa è il morbo di Crohn? E una malattia infiammatoria cronica dell'intestino (IBD o inflammatory bowel disease) che può colpire tutto il tratto gastrointestinale ma in genere si localizza nell'ultimo tratto dell'intestino tenue (ileite terminale) e/o nel grosso intestino (ileo-colite o colite di Crohn). Anche se le cause precise rimangono tuttora sconosciute, negli ultimi anni si pensa che alla base di tale malattia ci sia una risposta infiammatoria abnorme. Probabilmente in seguito ad una perdita della tolleranza immunologica o ad un'alterata permeabilità a livello intestinale, non solo si attiva la risposta immune ma soprattutto vengono a mancare i meccanismi fisiologici del suo controllo così da indurre un processo infiammatorio cronico. 28

29 Morbo di Crohn NOD2 ha un duplice ruolo: quando viene stimolato da solo attiva il fattore NF-kB quando viene stimolato insieme al TLR2, il NOD2 riduce l attivazione di NF-kB da parte di TLR2 In un sistema fisiologico la situazione che si verifica è sempre la seconda, cioè NOD2 è un modulatore negativo del segnale di TLR2 29

30 In un individuo sano l attivazione di NF-kB da parte di TLR2 è limitata dall azione di NOD2. In un individuo affetto da morbo di Crohn, il NOD2 non esercita la sua funzione modulatrice, quindi TLR2 induce un eccessiva attivazione di NF-kB che fa aumentare nell APC la trascrizione di IL-12 e di IL-23 (un membro della famiglia di IL-12) 30

31 Morbo di Crohn (NOD2) una patologia multifattoriale grave a carico dell intestino infiammazione transmurale a chiazze lungo tutto il tratto gastrointestinale sintomi extra-intestinali a carico di cute, articolazioni, occhi Rischio di sviluppare tumore colonrettale. Sindrome di Blau o sarcoidiosi ad esordio precoce (NOD2) rara patologia con eritema cutaneo uveite artrite formazione di granulomi Esistono 3 (+) varianti di NOD2 che conferiscono una maggior suscettibilità al morbo di Crohn sono localizzate nel LRR del NOD2, che non è in grado di modulare l attivazione del NF-kB Le mutazioni di NOD2 associate alla BS sono localizzate nel CARD e rendono il NOD2 sempre attivo anche in assenza di stimolo Continua attivazione di NF-kB 31

32 RLR (RIG-I like helicases) 32

33 RIG-I retinoic acid inducible gene I MDA5 melanoma differentiation associated gene 5 LGP2 laboratory of genetics and physiology Riconoscimento di virus a RNA Produzione di IFN di tipo I (alpha/beta) Risposta immunitaria anti-virale (apoptosi di cellule infettate, resistenza antivirale, attivazione NK & T cells) 33

34 Rappresentazione schematica del RIG-I e degli altri RLRs Yoneyama M, Fujita T J. Biol. Chem. 2007;282:

35 Come si attiva RIG-I? 35

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37 PRR solubili 37

38 PRR solubili Proteine della fase acuta ( es. proteina C-reattiva); riconoscono la fosfolipina dei lipolisaccaridi Collectine: Lectina Lectina legante il mannosio (MBL); Proteine surfactanti (SP-A / SP-D) (polmone) riconoscono i carboidrati batterici (mannosio) 38

39 I PRR di membrana (scavenger e recettori per il mannosio) e quelli solubili (proteine della fase acuta e collectine) sono importanti per stimolare la fagocitosi e l endocitosi 39