Idrolisi di Esteri -Criteri generali

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1 Idrolisi di Esteri -Criteri generali Idrolisi di esteri Esistono molte poche esterasi che possono essere utilizzate per l idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sono la PLE (pig liver esterase) HLE (horse liver esterase) ) e la ACE (acetilcoline esterase) ) estratta dall anguilla elettrica. Possono essere anche utilizzare le cellule microbiche, ma questo limita la variazione delle condizioni di reazione. Ampi screening per individuare nuove esterasi e per esprimerle in microorganismi ospiti sono in corso Fortunatamente per queste reazioni possono essere utilizzare anche le proteasi.. Le più utilizzate sono la α-chimotripsina e la subtilisina. Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la tripsina, pepsina, papaina e la penicillina acilasi In generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configurazione di un amminoacido L Substrato tipo per esterasi e proteasi Idrolisi di esteri

2 Idrolisi di Esteri Regole generali Idrolisi di esteri Per entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegato il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un riconoscimento chirale massimo. I gruppi R 1 e R 2 possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi ciclici, ma la loro differenziazione sterica deve essere massimizzata. Non devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONH 2, NH 2 ) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui devono essere opportunamente protetti. Per i substrati di tipo I la funzione alcolica R 3 deve essere la più piccola possibile (Me, Et). Questo vale anche per quelli di tipo II (acetati o propionati). In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo stereocentro. Pig liver esterase (PLE) Idrolisi di esteri PLE è l esterasi più versatile. E un enzima complesso ed è formato da almeno cinque iso-enzimi, che sono associati come trimeri di tre singole proteine. Per il loro uso come biocatalizzatori possono comunque considerarsi come una singola proteina perché tutte mostrano reattività simili. IL ruolo biologico della PLE è quello di idrolizzare i vari esteri presenti nella dieta del maiale, e questo spiega l eccezionale tolleranza ai substrati. Per gli scopi pratici può essere utilizzato anche l estratto crudo, non necessariamente l enzima isolato. Le altre esterasi di fegato (pollo, criceto, cavallo, coniglio) si sono rivelate meno efficaci.

3 Idrolisi in condizioni blande con PLE Idrolisi di esteri (PLE) Le condizioni blande consentono di idrolizzare composti labili o altamente funzionalizzati che non resisterebbero alle condizioni idrolitiche acide o basiche Idrolisi regio e stereoselettive con PLE Idrolisi di esteri (PLE) Solo mono-acido trans

4 Asimmetrizzazioni di diesteri Idrolisi di esteri (PLE) Centro prostereogenico in α L aumentato ingombro sterico del gruppo R forza il substrato ad entrare nel sito attivo dell enzima con la funzione entiotopica. Si ottiene opposta selettività Asimmetrizzazione di esteri glutarici 3-sostituiti Idrolisi di esteri (PLE) Centro prostereogenico in β

5 Asimmetrizzazione di diesteri meso aciclici (esteri dell acido succinico e glutarico) Idrolisi di esteri (PLE) La presenza di una funzione ossidrilica porta ad ottenere stereoselezioni più elevate Asimmetrizzazione di diesteri meso ciclici Idrolisi di esteri (PLE) Influenza della dimensione del ciclo sulla stereoselezione e selezione ezione della funzione da idrolizzare. L estere dietilico del cicloesano viene idrolizzato lentamente e con basse stereoselezioni: importanza dell alcol utilizzato

6 Idrolisi di esteri (PLE) Composti utilizzati per le sintesi di composti bioattivi. I derivati eso sono substrati migliori degli endo La sostituzione del residuo organico influenza sensibilmente la stereoselezione. Anche l alcol utilizzato ha notevole importanza Asimmetrizzazione di diesteri meso ciclici Idrolisi di esteri (PLE) (Ciclopentanolo-monoestere,, building block per la sintesi di prostaglandine) Forte influenza della natura dell estere utilizzato. ee MAX =86% L acetilcolina esterasi (ACE)) è più selettiva e ha stereoselezione opposta al PLE. Con l ACE si osserva anche una forte influenza delle dimensioni del ciclo con inversione di selettività per cicli più grandi. Selettività simili sono state ottenute anche con delle lipasi (Candida Candida antarctica e porcine pancreas lipase)

7 Asimmetrizzazione di diesteri meso ciclici azotati Idrolisi di esteri (PLE) Il cis-diacetato (ee=92%) è un substrato migliore del cis-dicarbossilato (ee=75%), le stereoselezioni sono opposte Risoluzione cinetica di diesteri aciclici Idrolisi di esteri (PLE) Sono compatibili anche composti organometallici

8 Risoluzione cinetica di diesteri ciclici Idrolisi di esteri (PLE) N-acetilamino ciclopentano carbossilato: sintesi di analoghi carbociclici di nucleosidi ad attività anti-virale sintesi di prodotti naturali Risoluzione cinetica di diacetati ciclici Idrolisi di esteri (PLE) Forte influenza delle dimensioni del ciclo con inversione di selettività ettività per cicli più grandi

9 K 1 >k 3 k 4 >k 3 Utilizzo di esterasi microbiche Idrolisi di esteri Sono stati anche utilizzate cellule intere di batteri e funghi alternativamente agli enzimi isolati. Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes, Bacillus coagulans, Pichia miso, Rhizopus nigricans Le condizioni di reazione sono più complesse ma in alcuni casi le l stereoselezioni sono migliori La protezione della funzione carbossilica terminale come estere terz-butilico ne previene l idrolisi

10 Resting cells di Baker s yeast Idrolisi di esteri Per evitare problemi derivanti dal metabolismo degli organismi nelle n fermentazioni sono state utilizzare resting cells di Baker s yeast Un esempio interessante riguarda la risoluzione dell acetato del pantolattone,, un precursore dell acido pantenoico,, costituente di una vitamina del gruppo B Risoluzione del 1-alchin1 alchin-3-il il acetato con resting cells di Baker s yeast Idrolisi di esteri

11 Ulitizzo sintetico di 1-alchin1 alchin-3-oli Idrolisi di esteri Sintesi di derivati di acidi aril propionici Idrolisi di esteri L importanza dei derivati degli acidi arilpropionici come antiinfiammatori e prodotti agrochimici ha portato ad effettuare un intenso programma di screening che ha permesso di isolare una nuove esterasi dal Bacillus Sibtilis, la carbossil esterasi NP.

12 Sintesi di derivati di acidi aril propionici Idrolisi di esteri La presenza di un ossigeno legato allo stereocentro porta ad un inversione della selettività di idrolisi (questo non viene messo in evidenza con l assegnazione della configurazione assoluta degli stereocentri,, l ossigeno ha priorità maggiore rispetto al carbonio) Idrolisi di esteri Utilizzo di proteasi come esterasi: α-chimotripsina L utilizzo di proteasi per l idrolisi di esteri non naturali è stata applicata con successo già dal 1976 utilizzando principalmente lal papaina e l α-chimotripsina.. Perché il processo sia altamente selettivo è necessaria la contemporanea presenza di un sostituente te polare e uno idrofobico sullo stereocentro in α alla funzione esterea (analogamente a quanto avviene negli amminoacidi).

13 Idrolisi di esteri Idrolisi regioselettive: α-chimotripsina vs papaina La papaina è una delle poche proteasi utilizzate in sintesi organica di origine vegetale (la papaia). Altre proteasi vengono isolate dai fichi (ficina( ficina) ) e dall ananas (bromelaina( bromelaina). Idrolisi regioselettive: subtilisina Idrolisi di esteri è chirale? La selettività è completa, nella miscela di reazione non si è osservata la presenza di altri regioisomeri

14 Idrolisi di esteri Idrolisi chemo e stereoselettive: penicillina acilasi La penicillina acilasi è altamente selettiva nell idrolisi di un gruppo fenilaceto del substrato naturale, la penicillina G. Per cui gioca un ruolo importante nella chimica della rimozione selettiva di gruppi protettori (idrolisi selettiva di fenilacetati vs acetati Idrolisi di esteri Idrolisi chemo e stereoselettive: penicillina acilasi

15 Idrolisi stereoselettive: Aspergillus oryzae proteasi Una proteasi derivante dall Aspergillus oryzae,, utilizzato principalmente per la lavorazione del formaggio, ha mostrato elevate reattività e selettività nella risoluzione di substrati particolarmente ingombrati, carbossilati α,α,α-trisostituiti, sustrati per i quali le altre proteasi non mostrano particolari reattività e selettività CF 3 Ph OH MeO O Acido di Mosher: : agente derivatizzante chirale Chiral Derivating Agents (CDAs) (±) L 3 L 2 H XH + Ph MeO CF 3 O Cl L 3 L 2 H X O CF 3 OMe Ph + H O CF 3 L 2 X L 3 Ph OMe X=O, NH Analisi dei prodotti via NMR: Ph MeO CF 3 O OH -OMe 1 H NMR; -CF CF F NMR

16 Risoluzione dinamica con proteasi da Streptomyces griseus Sintesi del Ketorolac,, un agente anti-infiammatorio infiammatorio A ph = 9 il substrato racemizza mentre non racemizza l acido corrispondente. Perché? H O OEt O OEt O OEt N O N O N O Ottimizzazione della selettività Per ottimizzare reazioni enzimatiche che procedono con selettività tà non particolarmente elevate (E=3-20) possiamo agire sulle tre componenti principali: (bio)catalizzatore substrato mezzo di reazione La possibilità di scegliere un biocatalizzatore migliore è strettamente legata alla loro disponibilità. Per esempio vi sono poche esterasi mentra la scelta di lipasi è molto più vasta. Eventualmente si può modificare l enzima, per esempio mediante directed evolution.

17 Ottimizzazione della selettività Modificazione del substrato E la cosa più agevole, specie per un chimico organico. Si può agire principalmente sulla struttura tridimensionale del substrato e secondariamente sugli effetti elettronici. Questo può essere fatto agevolmente utilizzando differenti gruppi protettori che modificano temporaneamente la natura del substrato e poi possono essere rimossi Ottimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE modificazione del substrato Ottimizzazione della selettività Si sintetizzano una serie di ammidi che influenzano fortemente il i livello di stereoselezione e l induzione del processo

18 Ottimizzazione del processo modificazione del substrato Ottimizzazione della selettività Si può anche modificare la struttura del substrato rendendolo temporaneamente più rigido e ricco di elettroni Π Riduzione con Raney-Nickel Reazioni di desolforizzazione mediate da Raney Nickel Raney Nickel (Vedere anche riduzione doppi legami)

19 Quale è il prodotto atteso dalla reazione dei prodotti seguenti e Raney Nickel? Ottimizzazione della selettività Medium Engineering Variazione del mezzo di reazione Co-solventi solventi: : MeOH, t-buoh,, acetone, diossano, MeCN,, DMF, DMSO Aggiunte co-solvente solvente: : 10-50% Aumento della selettività Riduzione delle velocità di reazione Disattivazione dell enzima ad elevate concentrazioni di co-solvente Meccanismo di azione del co-solvente non chiarito Difficili previsione del risultati (trial & error) Studi effettuati principalmente su PLE

20 Ottimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE modificazione del mezzo di reazione uso di co-solvente Ottimizzazione della selettività Ottimizzazione della selettività Medium Engineering Variazione del mezzo di reazione Effetto del ph Le reazioni catalizzate da idrolasi vengono condotte generalmente in soluzioni acquose e a valori di ph ottimale per l enzima. Variazioni di ph possono portare a variazioni conformazionali dell enzima, E la cosa più agevole, specie per un chimico organico. Si può agire principalmente sulla struttura tridimensionale del substrato e, in maniera minore, sugli effetti elettronici

21 Medium Engineering Variazione del mezzo di reazione Effetto della temperatura Generalmente si crede che gli enzimi, analogamente agli altri catalizzatori esibiscono selettività più elevate a basse temperature. Questa risulta vero solamente nel caso delle idrolasi e delle deidrogenasi. Solo recentemente è stato proposta una spiegazione razionale dell effetto della temperatura sulla stereoselezione e si basa sulla s Temperatura di Racemizzazione. La Temperatura di Racemizzazione (T rac ) è la temperatura alla quale una reazione enzimatica procede senza alcuna stereoselezione, il che equivale a dire che l energia di attivazione ione dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale. La Temperatura di Racemizzazione (T rac ) è la temperatura alla quale una reazione enzimatica procede senza alcuna stereoselezione, il che equivale a dire che l energia di attivazione ione dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale.

22 La variazione di G con la temperatura può dipendere solo dal fattore per cui: A temperature inferiori a T rac, il contributo entropico è basso e la selettività dipende principalmente dalla H. Per cui aumentando la temperatura la selettività ( G ) diminuisce. A temperature maggiori di T rac la reazione è controllata principalmente dal fattore entropico ( S ) e un aumento di temperatura porterà ad un aumento di stereoselezione. Passando da temperature inferiori a temperature maggiori della T rac si potrà osservare un inversione della stereoselezione del processo. Questo avviene nel caso di una deidrogenasi di un organismo termofilo (Thermoanaerobium brockii) Modelli di Enzimi Per evitare un approccio trial & error, sono stati sviluppati dei modelli astratti che possono aiutare il ricercatore nella scelta e ottimizzazione del substrato. Molecular Modelling: Sistemi di calcolo di molecular modelling possono aiutare nella comprensione dei fattori che determinano la stereoselezione del processo. La struttura ai raggi X di un enzima fornisce un accurata descrizione della struttura dell enzima enzima anche se in condizioni statiche. Però, poiché il riconoscimento chirale emerge nella formazione del complesso substrato-enzima, un processo dinamico,il tentativo di predire la stereoselezone sulla base dei dati ottenuti da strutture ai raggi x è azzardato. Sono note le strutture di solo alcuni dei biocatalizzatori quali α- chimotripsina,, la subtilisina e alcune lipasi.

23 Nota la struttura tridimesionale di un enzima, si può cercare di predirre la selettività e il decorso stereochimico mediante: Costruzione del complesso substrato-enzima negli stati di transizione diastereoisomerici attraverso conti di dinamica molecolare. Il G viene determinati via calcoli force field fornendo risultati semiquantitativi della attesa selettività. Se non si hanno informazione sullo stato di transizione, si può cercare la migliore interazione del substrato nel sito attivo. Questo si fa simulando il sistema dopo riscaldamento e raffreddando lentamente. e. Si determinano così i due minimi di energia per i due complessi diastereoisomerici. Se è nota la sequenza degli ammino acidi si può stimare attraverso calcoli la struttura tridimensionale in analogia con altri enzimi i con che hanno un elevato numero di sequenze omologhe (almeno 60%) Modelli del Substrato Si costruiscono quando non si hanno informazioni sull enzima Modello del Substrato per la PLE

24 Modelli del Sito Attivo Si fanno delle mappature con differenti substrati. Più substrati si utilizzano più affidabile diventa il modello Modello del Sito Attivo per la PLE (ottenuto con più di 100 substrati) H = siti idrofobici,, P= siti polari Il gruppo estereo si deve posizionare nelle vicinanze della serina Lipasi Le lipasi sono enzimi che idrolizzano trigliceridi nei corrispondenti acidi grassi e glicerolo. Giocano un importante ruolo nelle biotecnologie poiché vengono utilizzati in processi alimentari e per la preparazione di intermedi chirali. Più del 35% delle bio-trasformazioni vengono effettuate con lipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi più studiati. Sono state clonate più di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di 12 lipasi. Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni esteree è differente da quello delle esterasi Lipasi Differente interazione fisico chimica con il substrato: l enzima non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomerica.

25 Lipasi e Esterasi: : cinetiche Lipasi Differente interazione fisico chimica con il substrato: l enzima non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomerica. Quando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda fase (lipofilica), si ottiene un brusco innalzamento della reattività. Attivazione all interfaccia: origina dal fatto che il sistema diventa attivo solo quanto la concentrazione del substrato raggiunge la CMC (concentrazione micellare critica) Attivazione all interfaccia: la spiegazione a livello molecolare del fenomeno è stato visto derivare da un riarrangiamento dell enzima: l enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua parte copre il sito attivo [Enz[ Enz]. a contatto con la fase-bifasica un piccolo peptide in α-elica si allontana e scopre il sito attivo e la lipasi si riarrangia nella forma attiva [Enz[ Enz]. Per cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte in mezzi bifasici. Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi organici immiscibili con l H 2 O (esano, etere etilico, toluene).

26 Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in prodotto) Per determinare l attività di una lipasi si utilizzano triacilgliceroli quali la trioleina e tributilina mentre per le esterasi si utilizza il p-nitroacetato O O O CO CO CO R R R lipasi OH OH OH + 3 R-COOH H 2 C O O NO 2 esterasi O + H 2 C OH HO NO 2 Co-solventi miscibili con l acqua attivano le esterasi mentre co- solventi immiscibili attivano le lipasi Le lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzioni piuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chirali, i, vista la natura dei substrati naturali In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo stereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza di un protone, (analogamente alle esterasi)

27 Criteri generali Per substrati di tipo III la catena R 3 deve essere sufficientemente lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficiente lipofilicità al substrato. D altro canto catene troppo lunghe portano a substrati con punto di ebollizionetroppo alto e alla formazione di schiume e emulsioni. n-butanoati sono normalmente gli esteri prescelti Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente substrati con configurazione R allo stereocentro alcolico. Molte proteasi (α-chimistripsina, subtilisina) ) mostrano stereoselezioni opposte. Nelle strutture risolte ai raggi x si è osservato che la disposizione della triade catalitica è invertita nelle due classi di idrolasi. Questa potrebbe essere l origine l dell opposta stereoselezione. Criteri generali Per substrati di tipo IV il residuo R 3 dell alcol deve essere preferenzialmente una catena alifatica lunga (n-butanolo). Per questi substrati si è osservata una preferenza nell idrolisi di esteri S. Funghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sono s enzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantità à su larga scala. Spesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamente ente correlati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoselezione, ma in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La loro attività dipende dal quantitativo di enzima presente nella preparazione razione e anche dal fornitore.

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29 Requisiti Sterici per le Lipasi Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base delle caratteristiche del substrato naturale

30 Lipasi di Pancreas Suino (PPL) E la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L estratto crudo contiene una serie di altre idrolasi oltre alla PPL (la forma parzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più alto). L estratto commerciale che contiene ca 5% di PPL viene chiamato pancreatina o steapsina. Contiene anche altre idrolasi (α- chimotripsina, colesterol esterase, carbossipeptidasi B, fosfolipasi) per cui la reattività osservata può originare dalle diverse specie. PPL è particolarmente attiva nell idrolisi di esteri primari mentre α- chimotripsina e colesterol esterase sia con esteri di alcoli primari che secondari. Idrolisi regioselettive con PPL Uno dei problemi principali nella chimica dei carboidrati riguarda la deprotezione selettiva di alcoli secondari Idrolisi regioselettive possono essere ottenute insieme a risoluzioni cinetiche PPL e α-chimotripsina mostrano stereoselezioni opposte

31 Idrolisi asimmetrica di derivati meso con PPL Risultati complementare con l idrolisi catalizzata da PLE Ee maggiori con modificazioni del substrato sintesi di prostaglandine carbacicliche trattamento della trombosi Idrolisi asimmetrica di gliceroli con PPL 1,3-propandioli achirali come substrato (fattori stereo-elettronici) elettronici) Migliori risultati con sistemi bifasici

32 Risoluzione di acetati biciclici Reattività delle diverse idrolasi contenute nel PPL L elevata selettività è dovuta ad una nuova idrolasi isolata dal estratto di PPL Idrolisi stereoselettiva di lattoni con PPL Influenza del sostituente sulla selettività Il lattone e idrossi acido si separano agevolmente a ph basico. Acidificando si recupera il secondo enantiomero come lattone

33 Risoluzione dinamica di ossazoloni con PPL Risoluzione di N-acil ammino acidi Risoluzione di epossialcoli con PPL Complementare all epossidazione di Sharpless

34 Addizioni elettrofile Interazione di un elettrofilo con il sistema Π Reazione dell intermedio elettrofilo con un nucleofilo Elementi chiave: E-N è un reagente polare E + è un elettrofilo N - è un nucleofilo Reazioni del cicloesene con reagenti polari

35 Addizioni di acidi alogenidrici HX (X= Cl, Br,, I) Processo analogo alla S N 1 Quale è il prodotto atteso nella seguente reazione?

36 Addizioni di acqua in ambiente acido (con base coniugata non nucleofila) Una bassa concentrazione di un nucleofilo debole minimizza la formazione del prodotto di sostituzione Catalizzatore Reazione di equilibrio H H + H 2 O H 2 SO 4 H OH H H Modificando le condizioni possiamo spostare l equilibrio a destra o a sinistra Principio della reversibilità microscopica

37 Proporre un meccanismo ragionevole per la seguente trasformazione Addizione di Cloro e Bromo L interazione del sistema Π con la molecola di bromo crea un dipolo poiché c è repulsione tra gli elettroni che circondano i nuclei di bromo ed il sistema Π

38 Addizione di Fluoro e Iodio F 2 molto reattivo, rompe anche legami C-H C H e C-CC I 2 molto poco reattivo, l equilibrio è spostato a sinistra (legame C-I C I è debole)

39 Reazione stereospecifica Reazione stereoselettiva Si ottengono i due enantiomeri 1:1 Si ottiene un racemo

40 Esercizio Assumendo che un alchene lineare reagisca come il cicloesene,, quale sarà il prodotto di reazione tra il cis-2-butene e Cl 2? E tra il trans-2-butene e Cl 2? Addizione di X 2 in acqua Sintesi di Aloidrine

41 Proporre un meccanismo che renda conto della formazione dell altro enantiomero, (1S,2S)-trans-2- bromocicloesanolo. Poiché lo iodio non addiziona ad un alchene per produrre un addotto stabile, può essere usato in un addizione in cui è presente un nucleofilo diverso dallo ioduro. Questa caratteristica viene utilizzata nel processo di iodolattonizzazione, illustrato nell equazione seguente Proporre un meccanismo per quetsa trasformazione: Quale è la stereochimica attesa del prodotto? E il prodotto chirale? E racemo?

42 Reazione di addizione ad alcheni aciclici Con che meccanismo si forma il (2S,3,3S)-2,3-dibromobutano?

43 Epossidazione stereospecifica di olefine con peracidi Magnesio monoperosso ftalato Epossidazione stereoselettiva Con peracidi chirali: stereoselezioni molto basse (ee( < 10%)

44 Epossidazione alcoli allilici La presenza dell ossidrile influenza la stereoselezione del processo Epossidazione alcoli allilici

45 Epossidazione alcoli allilici Reagente di Sharpless Meccanismo proposto

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47 Epossidazione degli alcoli allilici Reagente di Sharpless Reagente catalitico Ti(IV)/(+)-DET/ DET/t-BuOOH,, setacci molecolari Epossidazione degli alcoli allilici Reagente di Sharpless Doppia stereoselezione

48 Epossidazione di Sharpless - Risoluzione cinetica Epossidazione di alcoli allilici racemi con il reagente di Shapless (Ti(IV)-DET DET-terz-Butil idroperossido) s= relative rate

49 Candida sp. Lipasi Sono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida. I più utilizzati sono quelli di Candida lipolitica, C. antartica e C. rugosa. Lipasi di Candida rugosa Sono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari ciclici + veloce Modello del Substrato per Lipasi di C. Rugosa

50 L estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività con c esteri α-sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme isomeriche dell enzima che operano con differenti selettività anche se hanno o la stessa enantiopreferenza Forma A più selettiva e stabile Modificazioni non covalenti di Lipasi di C. Rugosa (trattamento con i-proh) Il semplice trattamento con i-proh acquoso (50%) porta ad una lipasi modificata che mostra un considerevole aumento di attività e stereoselezione

51 Lipasi di Candida antartica Questi enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno screening s effettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreme eme da usare in formulazioni per la detergenza I due isoenzimi sono abbastanza diversi: isoenzima A: Ca 2+ dipendente, termostabile,, molto stabile con trigliceridi in modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali. isoenzima B: non è Ca 2+ dipendente, meno termostabile,, attivo con un largo numero di substrati non naturali. Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Aspergillus oryzae e sono disponibili in larghe quantità Tipici substrati per lipasi di Candida antartica

52 Ottimizzazione della selettività con lipasi Possono essere utilizzate tutte le tecniche viste per le esterasi: variazioni di temperatura, ph e variazione dei parametri cinetici delle reazioni (riciclo del prodotto, risoluzione sequenziale). Sono inoltre disponibili un elevato numero di lipasi. Il mezzo di reazione può ò inoltre essere modificato passando preferibilmente a sistemi bifasici piuttosto che a sistemi omogenei. Modificazione del substrato Per incrementare la stereoselezione del processo si possono utilizzare izzare anche composti che abbiano stereocentri sia alla funzione acida e alcolica. Poiché l enzima è sensibile a tutta la struttura del reagente questa semplice modifica può incrementare sensibilmente la selettività. Si generano dei diastereoisomeri Il sistema selezione la miglior coppia alcol/acido (coppia match).

53 Inibizione enantioselettiva di lipasi Basi chirali (ammine o ammino alcoli) possono giocare un ruolo di inibitore incrementando notevolmente la selettività. Si tratta di una inibizione non competitiva, causata dalla coordinazione dell ammina a un diverso sito della lipasi che non idrolizza più uno die die esteri enantiomerici. Inibizione enantioselettiva di lipasi (Pseudomonas( sp. Lipasi) L utilizzo dei due enantiomeri porta ad effetti confrontabili