Prof. Giorgio Sartor Cinetica enzimatica Copyright 2001-2014 by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 1.9.2 25/03/2014 Spontaneità Una qualunque reazione chimica avviene spontaneamente se esolo se la variazione di energia libera ( G) è negativa: G T,p < 0 G T = T S A T e p costanti v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 2-1
Spontaneità Quindi, data una qualunque reazione chimica A B Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari G B < G A Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se: G finale < G iniziale v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 3 - Spontaneità ed equilibrio Quando G B = G A Quindi G = 0 La reazione è all equilibrio A B v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 4-2
Spontaneità e realtà Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica ( G < 0) avvenga con velocità apprezzabile. ATP + 2 P P P.. 2 ADP + Pi P + P P 2 G = -7.3 kcal mole -1 (-30.6 kj mole -1 ) a p 7 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 5 - Energia di attivazione In soluzione l ATP è stabile perché esiste l energia di attivazione. v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 6-3
Catalisi In assenza di catalizzatore: A + B C + D v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 7 - Catalisi G = Energia di attivazione Energia libera A + B G G C + D Coordinate di reazione v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 8-4
Catalisi In presenza di catalizzatore: A + K AK AK + B ABK ABK C + D + K v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 9 - Catalisi G c = Energia di attivazione in presenza di catalizzatore Energia libera G c A + B + K G AK + B C + D + K Coordinate di reazione v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 10-5
Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione gni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita ( G < 0), Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare l energia di attivazione: 2 0 2 2 + ½ 2 Catalizzatore : essuno = 18 kcal mole -1 Platino = 11.7 kcal mole -1 Catalasi = 5.5 kcal mole -1 ( = energia di attivazione) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 11 - In una reazione chimica A B v = k [A] Velocità di reazione [A] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 12-6
Una reazione enzimatica k 1 k E + S ES 2 E + P k -1 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 13 - In una reazione enzimatica E + S ES E + P Velocità di reazione Bassa concentrazione di substrato >[E] v = k' [E o ] Alta concentrazione di substrato >>[E] v = k'' [E o ] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 14-7
Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere proteine v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 15 - Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere proteine v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 16-8
Specificità degli enzimi Specificità Stereochimica Assoluta Di gruppo Di legame v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 17 - Specificità degli enzimi Specificità stereochimica steroide 11-β-monossigenasi 2 3 12 11 13 17 16 1 14 9 15 2 10 8 5 7 4 4 6 3 10 1 8 9 6 5 7 11 12 13 11-β-idrossi steroide 17 15 14 16 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 18-9
Specificità degli enzimi Specificità assoluta mannitolo-1-fosfato deidrogenasi C 2 C 2 C 2 P 3 - C 2 P 3 - mannitolo-1-fosfato fruttoso-6-fosfato v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 19 - Specificità degli enzimi Specificità di gruppo Proteasi -Leu-Arg-Gly-Phe- Taglia qui v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 20-10
Centro catalitico is57 Asp102 Ser195 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 21 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 22-11
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 ES R is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 23 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 Intermedio tetraedrico R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 24-12
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 25 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 R R Acilenzima Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 26-13
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 R is57 R Sito Specifico Ser195 Gly193 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 27 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 R Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 28-14
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + Intermedio tetraedrico R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 29 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 30-15
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 31 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 32-16
Meccanismo delle proteasi a serina v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 33 - Proteasi a serina (1AX) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 34-17
Proteasi a serina (1AX) Gly193 Ser195 is57 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 35 - Specificità degli enzimi Specificità di legame Esterasi Estere Acido + Alcool v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 36-18
Classificazione degli enzimi Singolo enzima Ureasi Complesso enzimatico Complesso piruvato deidrogenasi v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 37 - Classificazione gerarchica degli enzimi gni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza. Viene classificato con un numero: EC X.Y.Z.T X = classe Y = sottoclasse Z = sotto-sottoclasse T = numero dell enzima nella sottosottoclasse http://www.enzyme-database.org/class.php http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/ http://www.brenda-enzymes.org/ http://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko01000.keg v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 38-19
Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: 1. ssidoreduttasi Catalizzano una reazione redox. 2. Transferasi Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una molecola ad un altra: X-Y + Z X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato. 3. Idrolasi Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=, C-, C-C, P--P, v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 39 - Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: 4. Liasi Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle ssidoreduttasi e dalle Idrolasi. 5. Isomerasi Catalizzano modificazioni geometriche. 6. Ligasi (Sintetasi) Catalizzano l unione di due molecole accoppiata al consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato. v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 40-20
Classificazione gerarchica degli enzimi Per esempio: Alcool + AD + Aldeide o chetone + AD ome comune: alcool deidrogenasi ome sistematico: alcool:ad + ossidoreduttasi EC 1.1.1.1 umero dell enzima nella sotto-sottoclasse La sotto-sottoclasse con AD + o ADP + come accettori La sottoclasse Agiscono sul gruppo di donatori C- La classe - ssidoreduttasi v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 41 - v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 42-21
v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 43 - v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 44-22
v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 45 - Isoenzimi Questa classificazione riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATRI La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione. Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono ISEZIMI v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 46-23
Isoenzimi Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio: EC 1.1.1.37 malato deidrogenasi Citosolica (codificata dal DA nucleare) Mitocondriale (codificata dal DA mitocondriale) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 47 - Cenni di cinetica chimica A k 1 k -1 B All equilibrio Velocità diretta v 1 = - Velocità inversa v -1 = - d[a] dt d[b] dt = k 1 [A] = k -1 [B] v 1 = v -1 k 1 [A] eq = k -1 [B] eq k 1 k -1 [B] eq = = K [A] eq eq v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 48-24
Cenni di cinetica chimica rdine di reazione I ordine II ordine I ordine rispetto ad A I ordine rispetto a B II ordine globale v 1 = k 1 [A] v 1 = k 1 [A] 2 oppure v 1 = k 1 [A][B] rdine 0 v 1 = k 1 indipendente dalla concentrazione dei reagenti v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 49 - Dipendenza dalla temperatura La velocità di una reazione dipende dalla temperatura attraverso la costante di velocità k v = k[a] All equilibrio k = A e - E att1 RT k A 1 e - E att1 RT 1 K - eq = = = Z e k -1 E - att1 A -1 e RT E att RT v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 50-25
Dipendenza dalla temperatura K eq = Z e - E att RT = Z e - G - T S RT = Z e - RT S = Z e - RT - R K eq = e - RT lnk eq =- RT E att 1 Energia Reagenti E att -1 E att 1 -E att -1 = E att E att Η Prodotti Coordinate di reazione v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 51 - Dipendenza dalla temperatura ln K eq ln K eq = - /R 1/T pendenza = - /R 1/T (K) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 52-26
Dipendenza dalla temperatura All equilibrio G = G + RT ln [Prodotti] [Reagenti] [Prodotti] [Reagenti] = K eq ; G = 0 0 = G + RT ln K eq G = - RT ln K eq G = - T S v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 53 - Enzima e substrato In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi: 1. Legame tra E e S per formare il complesso ES E + S ES >>[E] d[es] Stato prestazionario 2. Stato stazionario dt = 0; 3. Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 54-27
Enzima e substrato Concentrazione [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] Tempo v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 55 - Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d[p]/dt cost. [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] µs ms s m h Tempo v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 56-28
Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d[p]/dt cost. [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] µs ms s m h Tempo v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 57 - Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d/dt =cost d[p]/dt cost. d[p]/dt =cost d[es]/dt = 0 d[e]/dt =0 µs ms s m h Tempo v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 58-29
Enzima e substrato In una reazione enzimatica l ordine di reazione è variabile Velocità di reazione v = k[e] rdine 1 v = k[e] Pseudo ordine 0 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 59 - Enzima e substrato In una reazione enzimatica l ordine di reazione è variabile rdine 1 rdine 0 Velocità Velocità v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 60-30
Trattamento secondo Michaelis e Menten In una reazione enzimatica >>[E]: k 1 E + S ES (veloce) (1) k -1 k 2 ES E + P (lento) (2) v diretta = k 2 [ES] Per l equilibrio veloce (1) IDETERMIABILE k 1 K = = k -1 [ES] [E] IDETERMIABILE [ES] = k 1 k -1 [E] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 61 - Trattamento secondo Michaelis e Menten Per l equilibrio veloce (1) k 1 K = = k -1 [ES] [E] IDETERMIABILE [ES] = k 1 k -1 [E] [E tot ] misurabile [E tot ] = [E] + [ES] [ES] = k 1 k -1 ([E tot ]-[ES]) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 62-31
Trattamento secondo Michaelis e Menten Da cui [ES] = [E tot ] k -1 k 1 + k -1 = K d k 1 Costante di dissociazione del complesso ES ES k -1 E + S [E] [ES] k 1 = K d = Costante di Michaelis e Menten v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 63 - Trattamento secondo Michaelis e Menten La concentrazione del complesso ES [ES] = [E tot ] + Poiché: v diretta = k 2 [ES] v diretta = k 2 [E tot ] + v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 64-32
Trattamento secondo Michaelis e Menten Quando tutto E tot diventa ES allora la velocità sarà massima. = k 2 [E tot ] v = + Quando il substrato satura l enzima allora la velocità sarà massima v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 65 - Equazione di Michaelis e Menten v = + v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 66-33
Michaelis e Menten Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960) v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 67 - Efficienza catalitica o numero di turnover k 2 è detta anche k cat e si ottiene: k cat = [E tot ] k 2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s -1. ~1 s -1 < k 2 < 10 6 s -1 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 68-34
Trattamento secondo Michaelis e Menten Bassa concentrazione (relativamente) di substrato: << (rdine 1) v = Velocità di reazione Alta concentrazione di substrato: >> (rdine 0) v = = v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 69 - Trattamento secondo Briggs-aldane Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di E + S k 1 ES k 2 k -1 k -2 E + P Allo stato stazionario: d[es] dt = 0 = k 1 [E] - (k -1 [ES] + k 2 [ES]) formazione di ES scomparsa di ES [ES] = k 1 [E] (k -1 + k 2 ) v = + = k -1 + k 2 k 1 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 70-35
Significato di descrive l interazione substrato-enzima a livello del sito di legame. è, dimensionalmente, una concentrazione: k [E] -1 = K d = = ; moli l -1 [ES] k 1 È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della v = = ; 2 + 1 2 = ; + = v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 71 - Significato di E + S k 1 ES k 2 k -1 k -2 E + P è legata a k 2 = k 2 [E tot ] Dipende dalla concentrazione dell enzima (induzione). v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 72-36
Significato di k 2 k 2 è una frequenza /[E tot ] = k 2 (moli l -1 s -1 )/(moli l -1 ) k 2 = s -1 umero di eventi per unità di tempo (numero di turnover). Proprietà cinetica dell enzima. v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 73 - Significato di e v = v v = 2 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 74-37
Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000 Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico 0.1 0.04 acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014 -benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio 0.008 Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD+ 0.025 AD 0.018 Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica Acetaldeide enzimatica 1000-75 - Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000 Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico 0.1 0.04 acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014 -benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio 0.008 Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD+ 0.025 AD 0.018 Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica Acetaldeide enzimatica 1000-76 - 38
Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000 Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico 0.1 0.04 acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014 -benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio 0.008 Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD+ 0.025 AD 0.018 Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica Acetaldeide enzimatica 1000-77 - Linearizzazione dell equazione di Michaelis e Menten v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 78-39
Inversione Lineweaver-Burk v = + 1 v + K = = M 1 1 + v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 79 - Lineweaver-Burk 1 v K = M 1 1 + 1/v 1/ Pendenza = / -1/ 0 1/ v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 80-40
Eadie-ofstee Trasformazione v ( + ) = v + v = v v + = V max v v + = v/[s] / Pendenza = - 1/ v = - v 1 KM v v.1.9.2 gsartor 2001-2014 Cinetica enzimatica - 81 - Eadie-ofstee (oppure) Trasformazione v ( + ) = v + v = v v + = V max v v + = v Pendenza = - / v v= - + v/[s] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 82-41
Reazioni enzimatiche con più substrati Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale: Prima uno poi l altro in ordine preciso: Meccanismo sequenziale ordinato Senza un ordine preciso: Meccanismo sequenziale casuale Meccanismo a ping-pong v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 83 - Meccanismo sequenziale ordinato A + B E P + Q E + A EA; EA + B EAB; EAB EPQ; EPQ EQ + P; EQ E + Q v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 84-42
Meccanismo sequenziale casuale A + B E P + Q E + A EA B Q EP E + P A EAB EPQ P E + B EB EQ E + Q DA PLIMERASI DIIDRFLAT REDUTTASI v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 85 - Meccanismo a ping-pong A + B E P + Q E + A EA E'P E' + P E' + B E'B EQ E + Q A P B Q E E'A E'P E' E'B EQ E v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 86-43
Centro catalitico is57 Asp102 Ser195 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 87 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E + A R is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 88-44
Meccanismo delle proteasi a serina E A Asp102 R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 89 - Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E A E P R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 90-45
Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E P + B R is57 R Sito Specifico Ser195 Gly193 Acilenzima v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 91 - Reazioni enzimatiche con più substrati Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando l altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo: [B] 1/v 1/v [B] Sequenziale casuale 1/[A] Ping-pong 1/[A] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 92-46
Regolazione dell attività enzimatica I fattori che regolano l attività enzimatica sono: Temperatura Enzimi solubili o di membrana p Effettori Inibitori (inattivatori) Attivatori Effetti allosterici Concentrazione di substrati e prodotti Vie metaboliche Repressione o induzione genica v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 93 - Temperatura La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura. La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura. Denaturazione Aumento cinetico Velocità optimum Temperatura v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 94-47
Temperatura Ln v La temperatura influenza la fluidità di membrana Enzima solubile Ln v Enzima di membrana Temperatura di transizione della fase lipidica Temperatura alta 1/T Temperatura Temperatura 1/T bassa alta Temperatura bassa v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 95 - p La stabilità di una proteina dipende dal p. Alcuni processi coinvolgono valori estremi di p Pepsina Tripsina Aceticolinesterasi Velocità relativa 2 6 p 10 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 96-48
Effettori Attivatori Inibitori La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni Carica Concentrazione Enzima legato ad altre molecole v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 97 - Inibitori Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono l attività di un enzima, possono dare Inibizione reversibile Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un legame non covalente) l enzima Inibizione irreversibile Modificano in modo irreversibile l enzima v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 98-49
Inibitori reversibili A secondo delle loro caratteristiche si definiscono: Inibitori competitivi Inibitori non competitivi Inibitori acompetitivi v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 99 - Inibitori competitivi Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES. L inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S E + S ES E + P = K i I EI E + P Ki = [E] [ES] [I][E] [EI] v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 100-50
Inibitori competitivi Senza inibitore v = + v Con inibitore v = ( 1 + [I] K i ) + v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 101 - Inibitori competitivi Senza inibitore 1 v K = M 1 1 + 1/V 1/ Con inibitore 1 v -1/(app) K = M [I] 1 1 ( 1 + ) + K i 0 1/ v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 102-51
Sono molecole simili al substrato ccupano lo stesso sito di legame Inibitori competitivi SIT ATTIV DELL IZIMA SUBSTRAT IIBITRE PRDTTI SUBSTRAT ED IIBITRE SI LEGA ALL STESS SIT IL LEGAME DELL IIBITRE PREVIEE IL LEGAME DEL SUBSTRAT v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 103 - Biosintesi del colesterolo C 3 Viene sintetizzato nelle cellule epatiche a partire da acetil-coa per formare 3-R-mevalonato. C 3 CoA S Acetil-CoA (C n ) CoA S Tiolasi S CoA 3 C C 3 Acetoacetil-CoA S CoA CoA S MG sintasi S CoA MG-CoA reduttasi I riduzione II riduzione APD + ADP + + 3-idrossi-3-metil glutaril-coa MG-CoA C 3 S CoA ADP + + APD + C 3 3-R-mevalonato S CoA S CoA C 3 Intermedio legato all'enzima v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 104-52
MG reduttasi EC 1.1.1.34 È una glicoproteina di membrana del reticolo endoplamatico, Il suo peso molecolare è di 97 kd, Il sito attivo è rivolto verso il citoplasma. È anch essa regolata dal sistema protein chinasi. MG CoA ADP v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 105 - MG reduttasi EC 1.1.1.34 Viene inibita dalle statine, usate come farmaci per ridurre elevati livelli di colesterolo. Mevastatina v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 106-53
Inibitori competitivi v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 107 - Inibitori non competitivi Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi. L inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S E + S + I ES + I E + P = [E] [ES] K K i [I][E] i [I][ES] K K i = = M [EI] [ESI] EI + S ESI v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 108-54
Inibitori non competitivi Senza inibitore v = + v Con inibitore v = [I] ( 1 + ) K i + v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 109 - Inibitori non competitivi Senza inibitore 1 v K = M 1 1 + 1/V 1/ Con inibitore -1/ 0 1/ 1 v K = M [I] 1 1 [I] ( 1 + ) + ( 1 + ) K i K i v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 110-55
Inibitori non competitivi Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito SIT ATTIV DELL IZIMA SIT IIBITRI (REGLATRI) IIBITRE SUBSTRAT Ioni metallici (Cu ++ ) Complessanti (EDTA) Modulatori I ASSEZA DI IBITRE SI FRMA I PRDTTI SUBSTRAT ED IIBITRE SI LEGA A SITI DIVERSI LA PRESEZA DELL IIBITRE RIDUCE LA VELCITÀ DI FRMAZIE DEL PRDTT v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 111 - Inibitori acompetitivi Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato. E + S ES + I E + P = K i K i = [E] [ES] [I][ES] [ESI] ESI v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 112-56
Inibitori acompetitivi Senza inibitore v = + Con inibitore v v = [I] ( 1 + ) K i [I] ( 1 + ) + K i v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 113 - Inibitori acompetitivi Senza inibitore 1/V 1 v K = M 1 1 + 1/ Con inibitore -1/(app) 0 1/ 1 v K = M 1 1 [I] + ( 1 + ) K i v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 114-57
Riassumendo Inibizione competitiva K i E + S + I ES E + P = K i = [E] [ES] [I][E] [EI] Inibizione non competitiva EI + S E + S + I K i ES + I K i ' E + P K i ' = [I][ES] [ESI] EI + S ESI Inibizione acompetitiva E + S ES + I K i ' E + P ESI v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 115 - riassumendo [I] a = (1 + ) K i [I] a' = (1 + ) K i ' Tipo di inibizione V MAX app app essuna V MAX Competitiva on competitiva Acompetitiva V MAX V MAX /a V MAX /a a a /a /a v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 116-58
Inibitori irreversibili Inibitore Formula rigine Meccanismo Ione cianuro C - Mandorle amare Complessa gli ioni metallici nelle proteine Diisopropil fluorofosfato (DFP) 3 C C 3 F C 3 P C 3 Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo Sarin 3 C C 3 F P C 3 Sintetico Come il DFP Fisostigmina 3 C 3 C C 3 Frutto del calabar Come il DFP C 3 v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 117 - Inibitori irreversibili Inibitore Formula rigine Meccanismo Parathion C 2 5 2 C 2 5 P S Sintetico Come il DFP (particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di insetti) -tosil-lfenilalanina clorometil chetone (TPCK) S Cl Sintetico Reagisce con l is- 57 della chimotripsina R Penicillina S C 3 C 3 C 3 Penicillum otatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 118-59
Attivatori Sono molecole che aumentano (o permettono) l attività enzimatica Protezione dell enzima Glutatione Ioni metallici Attivazione per azione sulle subunità Enzima inattivo + camp Subunità + Subunità catalitica regolatrice Azione proteolitica su proenzimi v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 119 - Attivatori Azione proteolitica su proenzimi Tripsinogeno + Tripsina Enteropeptidasi Chimotripsinogeno + Proelastasi Elastasi + Procarbossipeptidasi + Carbossipeptidasi π-chimotripsina + α-chimotripsina v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 120-60
Effetti allosterici Un enzima allosterico è, in genere, un oligomero con subunità correlate. Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà cinetiche dell enzima. L effettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici). Sito attivo Sito dell effettore v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 121 - Effetto allosterico Un enzima allosterico è un oligomero con subunità correlate la cui attività (K m ) viene influenzate dal legame del substrato v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 122-61
Effetti allosterici Il legame con l effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da come una sigmoide. v v = n K + n n = indice di cooperatività (costante di ill) n = 1 nessuna cooperatività n > 1 cooperatività positiva n < 1 cooperatività negativa v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 123 - Effetti allosterici Il legame con l effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da come una sigmoide. v v = n K + n n = indice di cooperatività Emoglobina v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 124-62
Vie metaboliche Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono l una all altra. Le vie metaboliche sono regolate: Inibizione da prodotto A B C D E Attivazione da substrato Attivazione compensatoria A B C D E A B C D E P K X Y Z v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 125 - Vie metaboliche ramificate Inibizione multivalente A B C D E F G K X Y Inibizione cooperativa A B C D E F G K X Y v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 126-63
Vie metaboliche ramificate Inibizione cumulativa A B C D E F G K I Z X Y Inibizione di enzimi multipli A B C D E F G K X Y v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 127 - Catabolismo e anabolismo C S A B E F T Z X Y v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 128-64
Regolazione genica Un altra via con la quale viene regolata l attività di uno o più enzimi è attraverso l induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. EZIMA mra SITESI DEMLIZIE AMIACIDI Induzione Repressione DA v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 129 - Regolazione genica Un altra via con la quale viene regolata l attività di uno o più enzimi è attraverso l induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. EZIMA mra SITESI DEMLIZIE AMIACIDI Induzione Repressione DA v.1.9.1 gsartor 2001-2011 Cinetica enzimatica - 130-65
Crediti e autorizzazioni all utilizzo Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CAMPE Pamela, ARVEY Richard, FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BICIMICA [ISB 978-8808-17030-9] Zanichelli ELS David L., CX Michael M. I PRICIPI DI BICIMICA DI LEIGER - Zanichelli GARRETT Reginald., GRISAM Charles M. BICIMICA con aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VET Donald, VET Judith G, PRATT Charlotte W FDAMETI DI BICIMICA [ISB 978-8808-06879-8] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/ Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/ Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/ Rensselaer Polytechnic Institute: http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/mbweb/mb1/mb1index.html Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla rlandini dell Università di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/ Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l autore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor - giorgio.sartor@unibo.it 66