Elementi di Cinetica Enzimatica

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1 Elementi di Cinetica Enzimatica Dalla Termodinamica sappiamo che una reazione chimica può avvenire solo se il G è minore di zero. Riferiamoci alla ben nota reazione A): reazione A) ATP + H 2 O ADP + P I G = cal/mole e al suo inverso: reazione B) ADP + P I ATP + H 2 O G = cal/mole A) è una reazione esoergonica che peraltro non avviene da sola, piuttosto la troviamo accoppiata ad altre reazioni, per esempio nella reazione catalalizzata dall enzima Esocinasi e in tante altre reazioni. Ogni reazione è contraddistinta da G, il che consente di confrontare una reazione con un altra. Ma ricordiamoci che quello che conta è il G reale, riferito a determinate condizioni cellulari. Vedremo che la reazione A) avviene nei mitocondri, ma all incontrario, per sintetizzare ATP, ovvero in pratica avviene la reazione B) (non è altro che l inverso di A) che in tale caso richiede l accoppiamento a un donatore di energia. E ovvio che per decorrere verso la sintesi di ATP debba esistere una qualche forma di donatore di energia, perché in tale verso opposto (B)la reazione è endoergonica (con G = cal/mole). Vedremo che l energia per tale biosintesi dell ATP è fornita da un gradiente protonico. Tale sintesi (legata alla catena di trasporto degli elettroni, nei mitocondri) è importantissima, perché assicura agli organismi aerobi l approvvigionamento di quasi tutto l ATP di cui hanno bisogno. La proteina che, grazie a tale opportuno accoppiamento, sintetizza ATP, è la F 1 F o ATP sintetasi, che è formata da più subunità proteiche aggregate. La subunità F 1 è, in ultima analisi, quella responsabile della sintesi di ATP, ma solo se è correttamente accoppiata, attraverso F o ed altre proteine, al gradiente protonico. Avremo modo di conoscere le modalità di tale accoppiamento quando parleremo della catena respiratoria. Tale accoppiamento è nevralgico per il corretto funzionamento dei mitocondri, che contengono le subunità F 1 F o e che, ricordiamolo, sono la sede della sintesi aerobica dell ATP. Ma la subunità F 1 (che nei mitocondri è la responsabile in ultima analisi della catalisi della reazione B), è estraibile dai mitocondri ed è possibile utilizzarla isolata in provetta. Se in una provetta sistemiamo solo l ATP in H 2 O non succede assolutamente nulla. Ma se aggiungiamo la F 1 osserveremo una rapida idrolisi dell ATP. Ovvero F 1 isolata, e non accoppiata a F o, catalizza la stessa reazione, ma nel verso opposto a quello catalizzato dalla stessa F 1 nella sua sede naturale (i mitocondri). In buona sostanza F 1 è una proteina enzimatica, e catalizza sia la rezione A ( di idrolisi - se isolata) che la rezione opposta B (di sintesi dell ATP - nei mitocondri). Ovvero F1 ha la tipica proprietà di un catalizzatore: quella di poter catalizzare una reazione chimica sia in un senso che nell altro. Il verso è stabilito da altri fattori e l enzima non determina il verso della reazione. Occorre precisare, come riportato nella dispensa Elementi di Bioenergetica, che F 1 sintetizza ATP grazie ad un momento torcente, e di fatto costituisce una nanomacchina e avremo modo di fare altre considerazioni (anche evoluzionistiche) su questo straordinario e per certi versi unico dispositivo molecolare. Questo esempio illustra adeguatamente che un enzima è un catalizzatore biologico, e in quanto tale è in grado di accelerare una reazione, ritrovandosi inalterato alla fine del processo. Ma l apporto dell enzima non è assolutamente energetico. Verifichiamo anche, per quanto detto prima, che un catalizzatore non stabilisce il verso di una reazione. L esempio ora citato della F 1 F o sintetasi è al riguardo didascalico. Il verso è stabilito dalle condizioni locali (per esempio concentrazioni e azioni di massa di reagenti e/o prodotti) e dalle proprietà termodinamiche del processo stesso (valore e segno del G si ponga attenzione: è il G e

2 non il G che caratterizza un processo reale e, comunque, il G può variare mentre G è una costante ). Cinetica enzimatica Un enzima partecipa ad una reazione del tipo A B secondo lo schema: 2 k 1 k 3 A + E [AE] E + B k 2 A si lega ad E (l Enzima) per formare il complesso Enzima-Substrato. Alcuni dei complessi enzima-substrato sono stati illustrati. Tra essi è assai istruttivo il complesso formato dall enzima Citrato Sintetasi con i due substrati Acetil-CoA e Ossalacetato (vedi nel sito che automaticamente passa a Protein Data Bank- PDB) dove possiamo scaricare la scheda della Citrato Sintetasi di pollo (Codice 1AL6 ) (AN di Swiss Prott: P23007). In realtà a sinistra è rappresenta la molecola dell ossalacetato. A destra, assai più grande, è rappresentata la molecola dell Acetil-CoA (in realtà è un suo analogo, l Idrossi Amido-CoA, che è impiegato al posto del substrato vero, in quanto non reagisce). L enzima posiziona quindi le due molecole in posizione ottimale perché possano reagire. L esempio ora illustrato è riferito ad una reazione bimolecolare, ma potremmo illustrare anche reazioni su di un solo substrato. La grande proteina enzimatica crea una nicchia (o tasca) dove il substrato è posizionato per essere colpito dalla catena laterale dell amminoacido del sito attivo. Figura 1 Complesso Enzima-Substrato(i) k 1 nello schema è la Costante di Velocità (moli trasformate al secondo) del processo di formazione del Complesso Enzima-Substrato (ES) che è molto alta e in pratica è equilibrata dal processo di dissociazione di ES (caratterizzato dalla costante di velocità k 2 ) che pure essa è molto alta. Si stabilisce un equilibrio e la costante di dissociazione del complesso ES è assimilabile alla costante di Michaelis-Menten K M (v. pag. 4). Esiste poi una terza costante di velocità, k 3 (denominata Numero di Turnover) che è la costante di velocità di dissociazione del Complesso Enzima-Substrato, con formazione dell enzima libero E (E ritorna a parteciapare ad un altro ciclo catalitico legandosi ad A) e del prodotto di reazione B. k 3 è di gran lunga minore sia di k 1 che di k 2. La costante di velocità k 3 è assai importante, e la sua grandezza, calcolabile per qualsiasi enzima, fornisce una idea precisa della capacità catalitica di un enzima. La velocità della rezione (v) in moli/sec è data dall espressione: v = k 3 [ES] (Equazione 1)

3 quindi la velocità della reazione è uguale al prodotto di k 3 per la concentrazione del complesso ES. Estrapolando ricaviamo: 3 k 3 = v / [ES] v è espresso in moli/sec/litro. [ES] è in moli/litro, quindi k 3 ha le dimensioni di sec -1. In pratica è un numero diviso secondi. Visto che rappresenta Moli/Moli in pratica il Numero di Turnover è il numero di molecole di substrato elaborate da 1 Molecola di enzima ogni secondo. In pratica è la efficienza catalitica dell enzima. La definizione di k 3 è semplice e ci consente di comprendere l entità della efficienza catalitica. Nella Tabella 1 riportiamo 2 parametri ( K M, costante di Michaelis -la definiremo più avanti e k 3, il numero di Turnover) per alcuni enzimi. Tabella 1 Enzima K M ( Molarità) k 3 (sec 1 ) Carbonico anidrasi Acetil Colinesterasi 9, Lattato deidrogenasi 8, Chimotripsina Lisozima ,5 Veniamo così a sapere che gli enzimi hanno una efficienza straordinaria. Ogni molecola della proteina enzimatica carbonica anidrasi è in grado di elaborare molecole al secondo! In realtà è il numero di turnover più alto che si conosce è un valore assai diffuso, proprio di molti enzimi tra cui la Lattato deidrogenasi. Comunque anche 1000 è un valore assai alto. Questo parametro illustra bene e quantifica l efficienza catalitica di un enzima. Costante di Michaelis-Menten Possiamo studiare come varia la velocità di una reazione catalizzata da un enzima in funzione della concentrazione del substrato. Possiamo riferirci alle prove delle esperienze condotte in laboratorio, dove misuriamo varie velocità di reazione. In 5-6 vaschette da 1 ml (da utilizzare per le letture allo spettrofotometro) introduciamo un substrato (il G6P) dell enzima G6PD a concentrazioni crescenti (riportate in ascisse della Figura 2). In tutte le vaschette sistemiamo la medesima quantità di enzima. Teniamolo presente: la concentrazione di enzima è costante! Nel grafico a lato i 5 punti rappresentano le misure dirette ottenute dallo studente in laboratorio. La curva che interpola i punti è una iperbole equilatera. V max indica l asintoto, cioè il valore massimo della velocità. Ovvero non è possibile aumentare più di tanto la velocità, anche per concentrazioni elevate di substrato. Ciò esprime una proprietà di tutti gli enzimi: la saturabilità. Questo andamento (detto iperbolico) è caratteristico di molti enzimi, ma non di tutti. In particolare gli enzimi regolati presentano curve diverse dall iperbole e di forma sigmoide. Ne parleremo più avanti. v velocità iniziale della reazione ½ V max V max K M [S] Figura 2 Andamento della velocità iniziale della reazione enzimatica in funzione della concentrazione del substrato [S].

4 4 Esiste una equazione che lega il valore di v a quello di [S]: è l equazione di Michaelis-Menten. La si ottiene da 3 ipotesi di partenza (v. Campbell-Farrell 2 ed. pag. 148): Le due variabili (y ed x) sono, rispettivamente, v e [S]. In un grafico cartesiano (V. Figura 2) l andamento è quello di un iperbole equilatera. Uno degli asintoti (quello parallelo all asse delle x) è la V max. Questo è verificabile immediatamente. Per [ S ] che tende all infinito, il rapporto K M / [ S ] tende a zero, per cui v = V max. Definiamo ora la importante costante K M. D Equazione 2) V max v = K M 1 + [ S ] Abbiamo 2 definizioni di K M : Definizione 1): La K M rappresenta la concentrazione di substrato in corrispondenza della quale la velocità della reazione è 1/2 della V max. Anche questa proprietà della K M è immediatamente verificabile dall Equazione 2). K M ha le dimensioni di una concentrazione (compare a numeratore di un rapporto con [S]). Quando il valore di [ S ] eguaglia K M, il denominatore dell Equazione 1 diventa = 2, e quindi v = V max / 2. Pertanto la K M è correttamente rappresentata in Figura 2 sull asse delle ascisse e a tale valore corrisponde una v = ½ V max. Definizione 2): Scaturisce da una delle 3 ipotesi alla base dell equazione 2) ed è la seguente: K M è approssimabile alla costante di dissociazione del complesso Enzima-Substrato (ES). In base ad essa deduciamo che tanto più grande è K M, tanto più piccola è l affinità dell enzima per il suo substrato. Ma alla stessa conclusione (su base solo descrittiva) perveniamo con la Definizione 1). Infatti tanto più a destra è spostata l iperbole della figura 2) (enzima con minor affinità per il substrato) e tanto più grande sarà la K M. Quindi le 2 definizioni di K M sono assolutamente congruenti. Ora che abbiamo definito K M possiamo completare il commento della Tabella 1. Confermiamo che k 3 è l efficienza dell enzima (abbiamo già visto che indica il numero di molecole di substrato elaborate da 1 molecola di enzima in 1 secondo). K M esprime invece l affinità dell enzima per il substrato. Dalla Tabella 1 deduciamo che esistono enzimi con bassa affinità ma con alta efficienza (v. carbonico anidrasi) ed esistono enzimi con altissima affinità ma con bassa efficienza (v. lisozima). Linearizzazione grafica dell equazione di Michaelis-Menten La K M è desumibile direttamente dall iperbole ricavata sperimentalmente (v. Figura 2). Per ottenere un valore più accurato della K M si può utilizzare il metodo della linearizzazione grafica di Lineweaver-Burk, detto anche dei doppi reciproci, che è descritto anche nelle dispense del Laboratorio. Infatti vedremo che per ottenere K M, con questa procedura, tutti i valori di v in funzione di [S] ottenuti sperimentalmente concorrono alla determinazione di K M, e non solo i 2 punti più vicini a ½ di V max. indicati nel grafico. Inoltre la procedura dei doppi reciproci consente di comprendere subito, per un determinato enzima, se questo ha cinetica classica iperbolica, oppure se presenta altre forme di cinetica non-iperboliche. Rimaneggiando la Equazione 2) otteniamo la Equazione 3) che consente una diversa rappresentazione dei valori cinetici sperimentali. Ricordiamo che la Equazione 3) non è altro che la Equazione 2) espressa in un modo diverso. L equazione è assimilabile a quella di una retta del tipo y = a + bx Equazione 3) 1 1 K M 1 = + v V max V max [S]

5 Dove y (riportato in ordinate) è 1/v dell equazione 3). a è l ordinata all origine della retta e corrisponde a 1/ V max. b è il coefficiente angolare della retta e corrisponde a K M / V max dell equazione 3). Infine la variabile x coincide con 1 / [S]. 5 In pratica, anche nel laboratorio di biochimica frequentato dallo studente, i valori di v ottenuti a determinate concentrazioni di substrato [S] sono trasformati nei loro valori reciproci e, in un grafico cartesiano, si riporterà 1/v in funzione di 1/[S]. (Potrebbero essere i 5 punti rappresentati in Fig. 3). Vediamo ora come si ricava K M e V max. Si può verificare immediatamente che l intercetta con l asse delle ordinate è 1/ V max, lo abbiamo già evidenziato prima. E per calcolare K M? Possiamo vedere quanto vale l intercetta sull asse delle ordinate. Possiamo saperlo se imponiamo alla retta che l ordinata sia = 0. Sostituiamo pertanto nell equazione 3) a 1/v il valore 0. Avremo: 1 K M 1 0 = + V max V max [S] Eliminiamo V max a destra e a sinistra. Si ottiene che l intercetta con l asse delle ascisse avverrà in corrispondenza di: 1 1 = K M [S] 1 v 1 V max K M [S] Figura 3 Diagramma dei doppi reciproci 1 K M 1 = V max V max [S] Equazione 4) Quindi per conoscere K M è sufficiente calcolare il segmento riportato nella figura 3) (intercetta della retta con l asse delle ascisse) e calcolarne l inverso. Esiste più di un vantaggio da questa rappresentazione: 1) si può verificare immediatamente se la cinetica espressa da un enzima è di tipo iperbolico, in quanto i punti del grafico dei doppi reciproci devono, in tale caso, giacere su di una retta; 2) tutti i punti ottenuti sperimentalmente concorrono alla formazione della retta e quindi le determinazioni sia di K M che di V max risultano più accurate; 3) si possono osservare e calcolare meglio gli effetti degli eventuali inibitori (v. Capitolo 6 Figure 6.12 e 6.13 del Campbell-Farrell).

6 6 Per unità di enzima (EU) si intende: Definizione di Unità Enzimatica (EU) La quantità di enzima che trasforma 1 µmole di substrato in 1 minuto primo a temperatura definita (di norma 37 C). Quindi è una quantità. Vediamo di materializzarla in g di proteina o in moli ma, con tutta probabilità, sarà opportuno parlare di sottomultipli. Vedremo, infatti, che le grandezze con cui avremo a che fare sono i nanogrammi (ng) e le nanomoli (nmoli). La temperatura può anche non essere 37 C. Spesso la temperatura utilizzata per condurre le misure è 25 C. Per comprendere meglio a quali proprietà dell enzima si fa riferimento per dmisurare le Unità di un enzima, richiamiamo l eq 1: V = k 3 [ES] Tale equazione, applicata alla concentrazione di E T diventa: Equazione 6) V max = k 3 [E T ] perché quando tutto l enzima (cioè l enzima totale, E T ) partecipa alla reazione, ovvero la concentrazione del complesso Enzima-Substrato [ES] diventa [E T ], la velocità della reazione catalizzata corrisponderà alla velocità massima V max, che è l asintoto della Figura 2 di pag. 3. (k 3,che è il numero di turnover, detto anche k cat ) ovviamente è sempre la stesso, visto che è una costante Se in un certo recipiente (p.es. la vaschetta dello spettrofotometro) io rilevo che la rezione di un certo enzima decorre con la trasformazione di - x µmoli di substrato in prodotto al minuto, in quel recipiente avrò immesso x unità di enzima. Dimensionamento della quantità di enzima e valutazione del numero di turnover E utile dimensionare la quantità di enzima che utilizziamo in laboratorio. Riferiamoci, per esempio alla reazione catalizzata dall enzima Glucosio-6-P-Deidrogenasi (G6PD). Per il momento possiamo anche non entrare nello specifico della natura chimica dei composti chimici coinvolti. Il Docente scioglierà 20 µg di proteina enzimatica in una provetta da 10 ml. Ovvero la concentrazione della proteina G6PD corrisponderà a 2 µg /ml, ovvero ng/ml. Lo studente immetterà 20 µl di tale soluzione nella vaschetta ( o cuvetta) da 1 ml dove seguirà la reazione allo spettrofotometro. Quindi immetterà nella vaschetta 1/50 di ml (perché 20 µl corrispondono a 1/50 di ml) e quindi 1/50 di ng, ovvero la quantità totale di proteina enzimatica immessa in vaschetta è 40 ng ( : 50). A quante moli corrispondono 40 ng di G6PD? Vedremo che anziché moli avremo a che fare con le nmoli (nano moli) cioè 1 miliardesimo della mole! In vaschetta abbiamo 40 ng/ml. E opportuno riferirci a Litro, ed allora la concentrazione diventa ng/litro. Possiamo approssimare, per comodità, a ng/litro. Poiché Il Peso Molecolare della G6PD è circa Dalton, la nostra soluzione è 1 nm. Ripetiamo: la concetrazione dell enzima è dell ordine dell 1 nm

7 Infatti la molarità corrisponde alla moli/litro e, ovviamente, la nanomolarità corrisponde alle nanomoli presenti in 1 Litro. 7 Vediamo adesso la concentrazione del substrato, che è il Glucosio-6-Fosfato. La concentrazione cui corrisponde la V max, è 1 mm (1 mmolare). Queste misure saranno condotte dallo studente in laboratorio. la concetrazione del Substrato è dell ordine dell 1 mm Quindi tra concentrazione del Substrato (1 mm) e concentrazione dell enzinma (1 nm) esiste un rapporto di a 1. Ovvero per ogni molecola di enzima nella cuvetta è presente anche 1 milione di molecole di substrato. Questo dimensionamento è interessante perché ci fa tocccare con mano quanto efficiente sia l enzima, specialmente se si passa a calcolare il numero di turnover. Infatti, già si era detto che l efficienza di un enzima era quantificata dal numero di turnover, che può variare da 0,5 a sec -1 (v. Tabella 1 pag. 3). Vediamo di calcolare il numero di turnover per il dosaggio dell Enzima G6PD che lo studente effettuerà in laboratorio. Occorre conoscere la V max, quella ottenuta a conc. saturante di substrato. Lo studente verificherà in laboratorio che tale V max è circa 2,4 nmoli di substrato trasformato, in 1 ml di soluzione e in 1 minuto. Occorre rapportarla a Litro: V max sarà nmoli/litro.minuto - Quindi a secondo (basta dividere peer 60): V max sarà 40 nmoli/litro. secondo Visto che la concentrazione dell E T è già stata valutata dell ordine del 1 nm (cioè 1 nmole/litro) dalla semplicissima equazione 6) ricaviamo: k 3 = V max / [E T ] Quindi: k 3 40 nmoli_ Litri -1 sec -1 1 nmole Litri -1 In conclusione: numero di turnover dell enzima G6PD 40 sec -1 Quindi la G6PD utilizzata in laboratorio ha un numero di turnover piuttosto basso, se confrontato con quello in genere più alto di altri enzimi (v. Tabella 1 di pag. 3). In definitiva ogni molecola della proteina enzimatica G6PD elabora 40 molecole del substrato Glucosio-6-Fosfato ogni secondo.

8 Appendice: Analisi 3D dell Enzima Esocinasi umana complessata con i substrati E possibile analizzare l interazione tra l enzima Esocinasi e i suoi substrati. La reazione catalizzata dall Hexokinase è la seguente: 8 Hexokinase Glucosio + ATP Glucosio-6-Fosfato + ADP G = cal/mole La reazione presenta un G largamente negativo e quindi possiamo considera rla irreversibile. Inoltre l enzima presenta la proprietà di essere regolato: in presenza di concentrazioni elevate di Glucosio-6-fosfato presenta una diminuita capacità catalizzante. L enzima dei vertebrati, uomo compreso, è costituito da una lunga catena polipeptidica formata da più di 900 AA che si ripiegano formando due domini. I Primi 450 AA a partire dall N-.terminale costituiscono il dominio regolatore, mentre il secondo dominio è quello catalitico. Il primo dominio lega Glucosio-6-Fosfato, mentre il secondo lega glucosio e ATP e li pone in condizioni di reagire per effetto di prossimità. Questa realtà è ben documentata dagli studi a rx reperibili con il codice PDB: 1DGK Apriamo l Home Page di PDB e digitiamo il codice 1DGK Scarichiamo il file di testo operando nella scheda in alto a destra. Apriamo tale file con il programma RasMol o con altri programmi più complessi per l analisi della struttura 3eD di proteine. Con RasMol chiediamo in Display: Wireframe e in Colour: Chain. Si ottiene la seguente immagine (per poterla archiviare da RasMol utilizzare Export e salvare come immagine (v. pag. 9). Si può verificare che: 1) il dominio di destra è quello C-terminale (catalitico) e 2) le molecole inserite delle fenditure sono (partendo da destra) il glucosio e l ADP. Compare ADP (e non ATP che è il vero substrato) in quanto l ATP viene rapidamente convertito in ADP dalla proteina enzimatica. Utilizzando le funzioni di Ras Mol lo studente può verificare molti dati strutturali. Interessante è la individuazione della lunga alfa elica che collega i due domini. E possibile descrivere tutte le interazioni che sia Glucosio che ADP stabiliscono con la proteina.

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