Valutazione rapida del grado di maturità tecnologica e fenolica del nebbiolo di Valtellina mediante spettroscopia FT-NIR e Spettroscopia Vis-NIR * G. Cabassi (1), R. Beghi (2), N. Sinelli (3), R. Tonesi (4), R. Guidetti (2), E. Casiraghi (3) 1 Fondazione Fojanini di Studi Superiori, Via Valeriana 32, 23100, Sondrio 2 Istituto di Ingegneria Agraria, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 2, 20133 Milano 3 DiSTAM, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 2, 20133 Milano 4 Regione Lombardia, Direzione Generale Agricoltura Lavoro finanziato dalla Regione Lombardia, Progetto Innovì Riassunto Nel corso dell annata 2005 gli omogeneizzati delle uve, provenienti dai 5 campionamenti finali dei vigneti guida della zonazione viticola della Valtellina, sulle quali erano stati determinati i classici indici di maturità tecnologica (gradi Brix, acidità e ph) e quelli di maturità fenolica secondo Glories (antociani potenziali, antociani estraibili e polifenoli totali), sono stati analizzati mediante spettroscopia NIR a Trasformata di Fourier e spettroscopia Vis/NIR per la determinazione della data di vendemmia. Gli spettri NIR sono stati acquisiti con uno spettrometro a Trasformata di Fourier (MPA, Bruker Optics) nell intervallo spettrale tra 1000-2500 nm. Per l analisi nella regione Vis/NIR (400 1000 nm) è stato utilizzato uno spettrometro portatile, economico, a monocromatore reticolare fisso, a rivelatore di tipo CCD (2048 pixel), equipaggiato con un sistema di campionamento a fibra ottica. Sia i modelli ottenuti con FT-NIR che con Vis/NIR sono risultati adeguati per seguire la maturazione tecnologica, sebbene entrambi i sistemi non siano in grado di discriminare fra gli ultimi campionamenti. L analisi dei risultati Vis/NIR in cross-validazione delle calibrazioni sui parametri di maturità fenolica ha permesso di dimostrare come questo dispositivo sia in grado di individuare, nella maggior parte dei casi, il picco di maturità fenolica (SECV=85 mg/kg) e prevedere l estraibilità degli antociani (SECV = 53 mg/kg). La correlazione bidimensionali 2D tra i set spettrali dei due strumenti, ha evidenziato una relazione tra le seguenti coppie di assorbimenti: 575-450 nm (Vis-NIR) e 1185 nm (I e II overtone dello stretching C-H nella regione NIR), 575 nm (Vis-NIR) e 1540 nm (I overtone dello stretching O-H) e 820-840 nm (Vis-NIR ) con la regione 2065-2300 (bande di combinazione O-H e C-O dei carboidrati). Si evince quindi una correlazione tra le bande Vis-NIR ascrivibili alla frazione antocianica glicosilata delle uve (540-575 nm) con alcune zone spettrali NIR, attribuibili all assorbimento degli zuccheri. Introduzione La problematica della corretta individuazione della data di vendemmia e della definizione di criteri di valutazione e di pagamento delle uve che considerino oltre al tenore in zuccheri anche la ricchezza polifenolica delle uve è particolarmente sentita dalla moderna industria enologica [1] La produzione vinicola valtellinese fondata sull utilizzo di uve di nebbiolo (vitigno localmente definito chiavennasca ), tipicamente poco dotate di sostanze coloranti, a fronte di un mercato che richiede vini rossi di colorazione intensa, richiede metodiche veloci per caratterizzare il potenziale antocianico delle uve [2]: il massimo accumulo di sostanze antocianiche nelle bacche d uva è infatti spesso anticipato rispetto a quello di zuccheri e gli antociani vengono degradati con il proseguire
della maturazione [3]. La possibilità di valutare rapidamente tale potenziale permetterebbe la vendemmia a maturità fenolica da parte delle grandi aziende e dei piccoli produttori conferenti, incentivabili attraverso il pagamento differenziato del prodotto: la produzione potrebbe così ridurre i blending con uvaggi più colorati, ma non autoctoni, e il taglio dei vini che riducono la tipicità del prodotto. La scuola enologica bordolese per prima ha sviluppato delle tecniche analitiche rapide per la valutazione del contenuto antocianico e polifenolico nonché del tasso di estraibilità in vinificazione delle sostanze coloranti: il metodo di Glories [4] è oggi quello più diffuso, validato ed accettato per la valutazione della maturità fenolica delle uve; la sua applicabilità pratica tuttavia, richiedendo una lunga fase di estrazione e purificazione del campione e la presenza di personale di laboratorio qualificato, risulta limitata per ragioni di costo e numerosità dei campioni, sopratutto nella realtà produttiva Valtellinese, caratterizzata da appezzamenti terrazzati di dimensioni ridotte e da elevatissima variabilità altitudinale e di esposizione [5,6]. Le tecniche spettroscopiche NIR e Vis/NIR qui indagate potrebbero costituire un metodo valido ed economicamente sostenibile per la valutazione simultanea delle caratteristiche di maturità tecnologica (grado zuccherino, acidità e ph) e fenolica (antociani potenziali, estraibili e polifenoli totali) delle uve applicabili anche in realtà produttive ad elevata variabilità e ridotta estensione come quelle valtellinesi. Materiali e Metodi La sperimentazione è stata condotta sulle uve provenienti dai 5 campionamenti finali (da Settembre ad Ottobre 2005 con uve completamente invaiate) dei vigneti guida della zonazione viticola della Valtellina che vengono normalmente effettuati per la costruzione delle curve di maturazione tecnologica e fenolica. I parametri di maturità tecnologica, ph, acidità totale e gradazione zuccherina ( Brix), sono stati misurati sul mosto ottenuto dalla spremitura manuale delle bacche e illimpidito per sedimentazione. La maturità fenolica è stata valutata secondo la metodica di Glories che prevede due diverse estrazioni di un omogeneizzato d uva: una in condizioni blande con una soluzione di acido tartarico tamponata a ph 3,2 (in prima approssimazione confrontabile con quella che avviene in vinificazione) per la determinazione degli antociani estraibili, l altra in condizioni più drastiche in mezzo acido a ph 1 (HCl N/10) atte a rimuovere completamente le barriere alla diffusione dei contenuti vacuolari delle cellule per la determinazione degli antociani potenziali e dei polifenoli totali. Gli estratti, dopo purificazione per filtrazione e centrifugazione, sono stati diluiti con una miscela di etanolo ed acido cloridrico a ph 0.6; per la determinazione degli antociani è stata
misurata l assorbanza a 520 nm contro un bianco ottenuto per decolorazione del campione con sodio metabisolfito, mentre per la misura dei polifenoli è stata determinata la densità ottica a 280 nm. Le misurazioni spettroscopiche sono state registrate sugli stessi omogeneizzati utilizzati per le analisi polifenoliche secondo Glories ottenuti per frullatura di 200 bacche complete di peduncolo e vinaccioli. Per l analisi nella regione Vis/NIR (450 990 nm) è stato utilizzato uno spettrometro portatile economico composto di uno spettroscopio AvaSpec 2048 di Avantes a monocromatore reticolare fisso e a rivelatore di tipo CCD (2048 pixel), equipaggiato con un sistema di campionamento a fibra ottica (FCR-19IR200-2-ME-S1 prodotta da Avantes) e di una sorgente di radiazione costituita da un faretto alogeno OSRAM della potenza di 50 Watt con temperatura di colore di 4500 K con massima emissione a 500 nm. Gli spettri sono stati ottenuti accumulando il segnale raccolto dal sensore per 30 millisecondi ed effettuando tre differenti misurazioni per campione. Gli spettri grezzi costituiti da 2048 punti sono quindi stati mediati e sottoposti a smoothing (15 punti), ottenendo una riduzione a 403 punti. Le misure spettroscopiche NIR sono state ottenute con uno spettrometro FT-NIR (MPA, Bruker Optics Srl, Milano, Italia) dotato di una sfera integratrice a riflettanza diffusa. I dati spettrali sono stati raccolti nell intervallo di numeri d onda da 12000 cm -1 a 3600 cm -1 pari a 833-2778 nm, con una risoluzione di 32 cm -1 e numero di scansioni pari a 64 sia per i campioni che per il background. Gli spettri a disposizione sono stati preelaborati (SNV + trasformazione in derivata prima e seconda; metodo Savitzky-Golay). Le matrici dei dati spettrali sono state sottoposte ad indagine statistica multivariata (Unscrambler v. 9.2, Camo, Trondheim, Norway) per la realizzazione di modelli di regressione PLS (Cross validazione) utilizzabili per una rapida stima quantitativa degli indici di maturità. Per ogni modello sono stati valutati i valori dei seguenti parametri statistici associati alle curve di calibrazione e di cross-validazione: coefficiente di correlazione (r cal, r val ), errore standard in calibrazione e in cross-validazione (SEC, SECV). L analisi di correlazione tra gli spettri NIR e Vis/NIR è stata eseguita utilizzando la tecnica di correlazione statistica bidimensionale proposta da Barton [7] : per questo scopo le matrici nelle due regioni spettrali, sono state sottoposte a correzione moltiplicativa dello scattering (MSC), e successivamente utilizzate per il calcolo delle correlazioni tra le singole coppie di lunghezze d onda utilizzando il software Matlab 7.0 (the MatWorks Inc.).
Risultati e discussione Figura 1 set spettrale Vis-NIR di omogeneizzati d'uva In figura 1 è possibile vedere il set spettrale Vis/NIR di 70 omogeneizzati d uva utilizzato per lo sviluppo delle calibrazioni. Gli spettri mostrano notevoli variazioni, sia tra i diversi campionamenti che tra i vigneti, soprattutto nella regione del visibile. Particolarmente significativa appare la banda a 480 nm attribuibile agli assorbimenti delle molecole antocianiche (sistemi π delocalizzati ai ph vacuolari riscontrabili nelle cellule delle bacche d uva). Nella regione a λ>800 nm le variazioni spettrali risultano molto più contenute. Per valutare la possibilità di determinare i più significativi costituenti dei campioni di uva omogeneizzata attraverso un unica analisi spettroscopica, sono state costruite curve di calibrazione per alcuni indici di maturità tecnologica (gradi Brix, acidità e ph) e di maturità fenolica (antociani potenziali, antociani estraibili e polifenoli totali). La tabella 1 riporta i risultati ottenuti nella regione Vis/NIR in calibrazione e in cross-validazione leave-one-out per gli indici di maturazione analizzati: per tutti i parametri presi in considerazione si sono ottenute correlazioni significative; in particolare gli indici di maturità fenolica sono stati predetti in maniera migliore con la strumentazione Vis/NIR portatile che con quella FT-NIR [8]. I valori di SECV per la stima delle concentrazioni di antociani e polifenoli sono particolarmente ridotti rispetto al range di variazione presentato dalla popolazione campionaria. Permettono quindi l individuazione del picco di maturità fenolica, adottando gli usuali intervalli di campionamento di 10 giorni, come evidenziato dagli esempi riportati in fig 2 e 3 dove vengono sovrapposte le curve di maturazione fenolica misurate e stimate in cross-validazione mediante le calibrazioni Vis/NIR, rispettivamente di un vigneto su conoide, con scarso accumulo di sostanze coloranti, e di uno su terrazzamento bene esposto ed ad alto potenziale antocianico. In entrambi i casi la tecnica spettroscopica consente di individuare il momento di massima estraibilità degli antociani, rispettivamente alla terza e alla seconda settimana di campionamento. I risultati ottenuti nella regione Vis/NIR per gli indici di maturità tecnologica risultano invece meno soddisfacenti sul piano dell utilità pratica, e in particolare per gli ultimi quando gli accumuli di zuccheri possono spesso risultare inferiori a 1 Brix nell arco di 7-10 giorni.
Variabile dipendente Pretrattamenti dati N di fattori Calibrazione Cross - validazione r cal SEC r val SECV range/secv Solidi solubili ( Brix) Acidità (mg/l ac. tart.) ph Antociani potenziali (mg/l catechina) Antociani estraibili (mg/l catechina) Polifenoli (DO 280 nm) 2 5 0.87 0.87 0.85 0.92 8.04 smooth. + d smooth. + d 2 7 0.89 1.08 0.86 1.22 10.01 smooth. + d 2 8 0.89 0.08 0.82 0.11 8.1 2 10 0.93 72 0.9 85 12.36 smooth. + d smooth. + d 2 11 0.91 43 0.86 53 9.71 2 8 0.88 2.65 0.84 3.02 11.19 smooth. + d Abs = Assorbanza; Red = riduzione; Smooth = smoothing; d 2 = derivata seconda Tabella 1 - Parametri statistici relativi alle rette di calibrazione e di cross-validazione PLS, per gli indici di maturazione tecnologica e fenolica Vigneto 'Ponte S Cristina' 900 Antociani estraibili Ant. estr. stima Vis-nir Ant. potenziali Ant. pot stima Vis Nir 1400 Vigneto 'Surana' mg/l catechina 800 700 600 500 400 300 mg/l catechina 1200 1000 800 600 400 200 7/9 14/9 21/9 28/9 5/10 12/10 19/10 data di campionamento 200 7/9 14/9 21/9 28/9 5/10 12/10 19/10 data di campionamento Figura 2: curve di maturità fenolica di un vigneto su conoide Figura 3: curva di maturazione fenolica relativa a un vigneto terrazzato e bene esposto Per meglio comprendere la natura e l informazione del segnale registrato nella regione 1000-400 nm con lo strumento portatile Vis-NIR è stata utilizzata la correlazione spettroscopica bidimensionale con i dati dello strumento FT-NIR secondo la tenica statistica proposta da Barton [9]. In figura 4 viene presentata la visualizzazione grafica, tramite un algoritmo di contouring per curve di livello, della matrice di correlazione tra il set spettale Vis-NIR (450 990 nm) e quello FT-NIR (833-2778 nm). Sulla base delle attribuzioni delle bande di assorbimento date da Shenk [8] per le principali molecole agroalimentari nella regione NIR, risultano particolarmente significative le
Figura 4 Correlazione 2D Vis-NIR FT-NIR correlazioni 575-450 nm attribuibili alla frazione antocianica (Vis-NIR) con 1185 e 1540 nm (I e II overtone dello stretching C-H nella regione NIR) e 575 nm (Vis-NIR) con 1540 nm attribuibile al I overtone dello stretching O-H ascrivibile ai carboidrati e agli zuccheri: le molecole antocianiche nelle bacche d uva sono infatti sempre in forma glicosilata. Anche le correlazioni 820-840 nm (Vis-NIR ) con la regione 2065-2300 (bande di combinazione O-H e C-O dei carboidrati) e 895-910 (Vis-NIR) con le bande 1188 e 1530-1540 NIR (I e II overtone dello stretching C-H nella regione NIR) risultano di grande interesse perché evidenziano la ricchezza di informazione della regione del vicino-vicino infrarosso in relazione alla composizione glucidico-carboidratica (saccarosio, pareti cellulari di bucce e vinaccioli) della matrice uva. Conclusioni I risultati ottenuti nell elaborazione dei modelli di regressione PLS su un primo set esplorativo di campioni di uva evidenziano la possibilità di utilizzare lo strumento portatile Vis-NIR testato per la valutazione del grado di maturazione delle uve. I buoni risultati ottenuti soprattutto per gli indici di maturazione fenolica suggeriscono di continuare a sviluppare questa strumentazione tecnica come alternativa economica ai metodi tradizionali, in quanto in grado di fornire risultati sufficientemente accurati in tempi ridotti con particolare riferimento all individuazione del momento di massimo accumulo di antociani estraibili: i SECV ottenuti per i polifenoli con questa prima calibrazione esplorativa risultano infatti sensibilmente inferiori alle variazioni riscontrate in campo tra i diversi campionamenti e potrebbero permettere l adozione di intervalli di campionamento anche inferiori a 10 giorni. Una standardizzazione del ph degli omogeneizzati per uniformare l assorbimento degli antociani, che sono molecole indicatrici e modificano quindi la loro colorazione in funzione del ph, potrebbe ulteriormente accrescere la sensibilità e il potere discriminante della tecnica. L analisi di correlazione bidimensionale, inoltre, mostrando nella regione del NIR vicino segnali associabili alla presenza di carboidrati e zuccheri, evidenzia la possibilità di raggiungere, con set campionari più grandi, risultati soddisfacenti anche per la stima dei parametri tecnologici. Bibliografia
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