REG. 16 DETERMINANTI GENETICI E FATTORI MODULATORI NELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE: MODELLI CLINICI E ANIMALI Responsabile scientifico di progetto AMALIA CECILIA BRUNI Centro Regionale di Neurogenetica AS6 Lamezia Terme U.O.4 Nicola Biagio Mercuri Fondazione Santa Lucia Ministero della Salute Ricerca Finalizzata Art. 12 e 12 bis, D. Lgs. 502/92 Finanziamento 2006
Sezione III: Attività per progetti ELENCO DELLE UNITÀ OPERATIVE COINVOLTE U.O.1 Associazione per la Ricerca Neurogenetica onlus, Lamezia Terme Antonio Laganà U.O.2 Centro Regionale di Neurogenetica, Lamezia Terme Rosanna Colao U.O.3 Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Biologia Cellulare Neuroscienze Reparto malattie degenerative, infiammatorie neurologiche, Roma Annamaria Confaloni U.O.4 Fondazione Santa Lucia, Laboratorio di Neurologia Sperimentale, Roma Nicola Biagio Mercuri DESCRIZIONE DEL PROGETTO Le demenze, malattia di Alzheimer (AD) e Demenza Frontotemporale (FTD) rappresentano una quota rilevante delle malattie neurodegenerative condividendone anche basilari meccanismi patogenetici. Le cause, identificate solo in una scarsa percentuale in mutazioni genetiche dell APP o delle Preseniline [Hardy J (1997) Trends Neurosci 20:154-1592; Price DL et al. (1998) Annu Rev Genet 32:461-493], di tau o progranulina, hanno, tuttavia, permesso di chiarire parte del meccanismo patogenetico e di costruire modelli animali inesistenti in precedenza. Il modello della dominanza mendeliana non si adatta, però, alle demenze ad esordio tardivo, per lo più sporadiche, che vengono considerate malattie complesse causate dall interazione genetico-ambientale. L allele e4 dell Apolipoproteina E (ApoE) è stato accertato come fattore di rischio e modulatore del fenotipo per l AD [Corder EH et al. (1993) Science 261:921-923] e per svariate altre demenze ma certamente non può essere l unico. È, dunque, necessario identificare nuovi fattori di suscettibilità e spiegare l elevata variabilità del quadro clinico relativamente a esordio, durata, progressione e pattern sintomatologici. In questa direzione, spunti interessanti sono rappresentati da proteine che interagiscono tra di loro e sono in grado di svolgere ruoli differenti. Le preseniline, ad esempio, espresse in una notevole varietà di tessuti ed organi, oltre a rivestire un ruolo fondamentale nella processazione della proteina precursore della bamiloide, regolano i segnali intracellulari nello sviluppo, nell omeostasi del Ca2+, nel processo dell apoptosi, nella regolazione del ciclo cellulare. Numerosi studi hanno mostrato che gli SNPs sono le forme più comuni di variazione genetica che si presentano nella sequenza nucleotidica del DNA, ed in grado, talora, di modificare la funzione biologica di una proteina. Uno dei maggiori obiettivi, perseguiti dalla ricerca genetica nell ultimo decennio, è stato quello di legare la presenza degli SNPs al rischio individuale di sviluppare alcune malattie neurodegenerative. Al momento sono stati elaborati ancora un numero esiguo di studi sull interazione tra diversi fattori di rischio, genetici (es. SNP), biochimici (es. colesterolo) e ambientali (es. scolarità) nel predisporre un individuo allo sviluppo di demenza. Obiettivo del presente progetto è delineare uno specifico profilo di rischio per ottenere una maggiore comprensione della complessa 680 2009
REG.16 Determinanti genetici e fattori modulatori nelle malattie neurodegenerative rete di interazioni metaboliche che regolano l insorgenza e l evoluzione della demenza e favorire la possibilità, se non di attuare una vera e propria prevenzione, almeno di poter ritardare l esordio della malattia. Ci si propone, inoltre, di identificare i differenti profili genetici che presentino maggiore efficacia di risposta nell attuale terapia con inibitori dell acetilcolinesterasi (AChE). OBIETTIVI Una delle ragioni della complessità della malattia di Alzheimer è sicuramente la sua natura multifattoriale, attribuibile, oltre alla supposta presenza di più geni causali, anche all interazione con fattori metabolici ed ambientali. È necessario, quindi estendere gli studi alla ricerca di nuovi fattori di suscettibilità capaci, probabilmente, di modulare l insorgenza e la progressione del fenotipo patologico. L AD e la FTD, si prestano molto bene a studi di associazione. È noto che specifiche combinazioni alleliche, quali gli aplotipi H1 e H2 del gene Tau, risultano essere fattori di rischio predisponenti alla malattia in diverse popolazioni. In particolare, l aplotipo H1, sia nella FTD che nell AD, risulta essere associato ad un maggiore rischio di sviluppare la malattia. Per quanto riguarda l AD, inoltre, molti studi hanno evidenziato come SNP rilevati in diversi geni coinvolti nel metabolismo del colesterolo (APOE, Cyp46, ABCA1, ABCA2), nel metabolismo dell Ab (PLAU, GAPD, NCSTN, PEN2, PSEN1(E318G), Fe65, IDE, neprilisina, OLR1) o in altre proteine (PRNP, COX-2, IGF-1 e P66SHC) possano costituire ulteriori fattori di rischio. È stato osservato inoltre che, poiché i fattori genetici sono responsabili della risposta individuale alla terapia farmacologica, i suddetti polimorfismi del DNA potrebbero essere utili per identificare i possibili differenti profili genetici di risposta (positiva o negativa). Questo contribuirebbe non solo alla conoscenza della risposta terapeutica ma permetterebbe l elaborazione di target farmacologici mirati. Studi di farmacogenomica condotti su gruppi ristretti hanno già evidenziato come variazioni di geni quali APOE, PON1, PON2, Cyp46, ChAT, possono modulare gli effetti della risposta agli inibitori di AChE. L obiettivo principale del presente progetto è, dunque, delineare specifici profili di rischio derivanti dall interazione dei fattori genetici e ambientali. In particolare: a) Realizzare studi caso-controllo su soggetti affetti da demenza per stabilire il contributo, indipendente o in associazione, di SNP presenti in diversi geni, in associazione con altri fattori di rischio biochimici e ambientali (es. colesterolo, ipertensione, distiroidismo, diabete, trauma cranico, scolarità etc.) nel costituire un profilo di rischio predisponente alla demenza. b) Verificare, per la popolazione analizzata, l esistenza di un effettiva associazione tra gli SNP considerati ed i fenotipi patologici. c) Studiare se la risposta ai farmaci inibitori dell AChE possa essere modulata da SNP presenti sui geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci e correlare la risposta con altre variabili (per es. familiarità). 2009 681
Sezione III: Attività per progetti d) Studiare gli effetti modulatori prodotti dall alterazione del pathway dell amiloide a livello elettrofisiologico e comportamentale, in modelli di animali transgenici in grado di riprodurre alcuni dei principali eventi fisiopatologici caratteristici dell AD. METODOLOGIA Popolazione La popolazione è costituita da soggetti affetti da demenza, in particolare da Malattia di Alzheimer (early e late onset, sporadica e familiare) e da Demenza Frontotemporale (early e late onset, sporadica e familiare). Il processo diagnostico utilizza la valutazione clinico-neurologica, neuroradiologica, i criteri multipli (NINCDS-ADRDA, NINCDS-AIREN, Roman, Lund e Manchester, McKeith), la scala di Hachinsky e la batteria di Caltagirone e Gainotti. Intervento Modello clinico. Sulla coorte verranno effettuate alcune valutazioni di parametri epidemiologici, biochimici e genetici. Nell anamnesi viene rilevata con una check list la presenza di disturbi psichiatrici, ipercolesterolemia, ipertrigliceridemia, ipertensione, cardiopatie, distiroidismo, diabete, trauma cranico. In caso di storia familiare positiva per demenza si procede alla ricostruzione anamnestico-genealogica del pedigree. I soggetti di controllo paragonabili ai pazienti per sesso, età ed area geografica, sono visitati dal punto di vista neurologico, valutati nelle funzioni cognitive con MMSE e sottoposti ad anamnesi per il rilevamento degli stessi fattori di rischio. Ai pazienti arruolati viene richiesto il consenso informato per l adesione allo studio e il prelievo di sangue. I dati demografici sono schedati e informatizzati. Il DNA estratto e raccolto nelle due Banche Biologiche organizzate presso le U.O.1 e 3 verrà impiegato per l analisi molecolare dell APOE, Aplotipi tau, Cyp46, ABCA1, ABCA2, PLAU, GAPD, PRNP (U.O.2), NCSTN, PEN2, PSEN1(E318G), Fe65, IDE, neprilisina, OLR1, P66SHC, COX-2, IGF-1 (U.O.3). Verranno inoltre studiati i livelli dell Ab 42 e Ab40 nel plasma dei pazienti arruolati e relativi controlli (U.O.3). Modello animale. Lo studio sul modello animale verrà espletato dall U.O.4 su modello di topi transgenici TG2576 utilizzando fettine di corteccia e di ippocampo mantenute in soluzione fisiologica. Verranno eseguite alcune registrazioni elettrofisiologiche extracellulare e del patch-clamp, nelle aree cerebrali maggiormente colpite nella malattia di Alzheimer, quali l ippocampo e la corteccia. Tutti i dati verranno raccolti e registrati (U.O.2) e quindi inseriti nel database già esistente presso l U.O.1. Sottoprogetto farmacogenomica Un sottogruppo di pazienti diagnosticati come affetti da AD e in trattamento farmacologico con inibitori dell AChE costituisce una coorte seguita semestralmente presso le U.O.1 e U.O.3; la progressione della patologia è valutata con MMSE, ADL, IADL, NPI. I pazienti saranno sottoposti anche allo studio molecolare degli SNP (PON1, PON2 e ChAT) coinvolti nel metabolismo dei farmaci (U.O.2). Sarà valutata la correlazione tra SNP e risposta farmacologica assieme ad altre variabili (età, scolarità, familiarità, presenza di mutazioni geniche, età 682 2009
REG.16 Determinanti genetici e fattori modulatori nelle malattie neurodegenerative di esordio, durata di malattia prima dell inizio del farmaco, genotipo APOE). Lo studio statistico in entrambi i progetti si avvarrà della regressione logistica multivariata per valutare il contributo, indipendente o in associazione fra loro, dei diversi SNP, e di essi in associazione con i diversi fattori di rischio biochimici e ambientali (U.O.2). Come indicatori per la valutazione saranno considerate le presentazioni dei dati a congressi nazionali e internazionali; e le pubblicazioni su riviste nazionali e internazionali. Il disegno di studio del progetto è caso-controllo e saranno studiati circa 500 soggetti affetti da Malattia di Alzheimer (di cui circa 200 familiari) e circa 120 affetti da Demenza Frontotemporale (di cui 40 familiari). Un centinaio di pazienti sono stati già reclutati grazie a precedenti progetti ministeriali (U.O.1 e 3). Il secondo studio (Sottoprogetto farmacogenomica) è uno studio di correlazione su una coorte, circa 100 pazienti affetti da AD, mutati e non, già in terapia con inibitori dell acetilcolinesterasi. La risposta ai farmaci sarà correlata considerando anche le variabili di cui sopra per identificare i differenti profili genetici che presentino maggiore efficacia di risposta nell attuale terapia con inibitori dell acetilcolinesterasi (AChE). TRASFERIBILITÀ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI Il progetto offre l opportunità di ampliare le conoscenze scientifiche relative ai fattori di rischio delle demenze e al ruolo che varianti del Dna possono giocare sull efficacia dei farmaci inibitori dell AChE. Lo studio potrebbe consentire l identificazione di differenti profili genetici utili per l elaborazione di target farmacologici mirati ad una terapia individuale con conseguente beneficio non solo per i pazienti ma anche per il sistema erogatore. L incremento delle conoscenze, nell ambito delle demenze, consentirà al Sistema Sanitario Nazionale di attuare una programmazione sanitaria più aderente alle necessità del territorio. La trasferibilità dei risultati è da intendersi per i soggetti affetti e le loro famiglie, il SSN, la comunità scientifica nazionale e internazionale, le agenzie regolatorie dell industria farmaceutica e le aziende farmaceutiche. I dati che comunque scaturiranno potranno essere inseriti sul sito dell ISS (www.epicentro.iss.it). I risultati potranno essere trasferiti ad altri ricercatori o ad operatori del SSN, attraverso monografie e note tecniche. I risultati generali che riguardano le patologie, le cause, i meccanismi coinvolti e le implicazioni cliniche saranno oggetto di pubblicazioni su riviste nazionali e internazionali o di comunicazione a congressi. Infine, questo progetto collaborativo, coinvolgendo istituzioni scientifiche di differenti regioni, ma anche un Associazione del terzo settore, testimonia il forte carattere di integrazione della ricerca scientifica e del suo alto valore sociale ed educativo. In quanto tale, esso potrebbe agire come catalizzatore ed essere d ispirazione in futuro per iniziative sanitarie e scientifiche simili. 2009 683
Sezione III: Attività per progetti OUTPUT DEL PROGRAMMA Progress report delle Unità Operative (alla fine del 1-2 anno). Scambio di ricercatori tra le Unità Operative del progetto (1-2 anno). Caratterizzazione dei differenti profili di rischio per demenza (2 anno). Caratterizzazione dei differenti profili di risposta al farmaco (2 anno). Presentazione dei dati preliminari a congressi nazionali e internazionali (1 anno). Presentazione dei dati conclusivi a congressi nazionali e internazionali (2 anno). Workshop sui risultati (2 anno). Pubblicazioni su riviste nazionali e internazionali (1-2 anno). OBIETTIVI INTERMEDI PREVISTI Standardizzazione di protocolli clinico-diagnostici. Screening clinico-genetico di popolazioni a rischio. Implementazione Banca Dati clinica. Implementazione Banca Dati biologica. Si allega il programma dettagliato dell Unità Operativa 4 che fa capo alla Fondazione Santa Lucia. 684 2009
REG.16 Determinanti genetici e fattori modulatori nelle malattie neurodegenerative U.O.4 Laboratorio di Neurologia Sperimentale Nicola Biagio Mercuri Contributo specifico fornito al progetto Il principale obiettivo della nostra U.O. è dedicato alla possibile identificazione di nuovi marker biologici di malattia di Alzheimer (AD) mediante lo studio di un modello sperimentale di AD con un approccio sia elettrofisiologico che comportamentale. Lo scopo di tale ricerca è di accrescere le nostre conoscenze circa i meccanismi cellulari e molecolari che mediano la morte neuronale in questa malattia degenerativa, ed è mirato alla possibile identificazione di nuovi markers biologici di malattia. Infatti, le modalità d azione dei fattori che determinano la predisposizione ad ammalarsi di AD non sono ancora conosciute. Inoltre, non sono ancora pienamente comprese le modificazioni funzionali che possono condurre alla precoce identificazione dei pazienti affetti da questa malattia. Pertanto, verranno condotti esperimenti su preparati, slices, di corteccia cerebrale ed ippocampale prelevati da topi transgenici. Si eseguiranno test comportamentali oltre a registrazioni elettrofisiologiche e microfluorimetriche, nelle aree cerebrali più colpite da tale malattia neurodegenerativa (ippocampo e corteccia). L identificazione di markers di malattia sul modello animale potrebbe risultare utile nel riconoscere simili alterazioni nei soggetti affetti. Metodologia Popolazione oggetto di studio Per il nostro studio utilizzeremo dei topi transgenici Tg2576 che sovra-esprimono il gene umano mutato (mutazione svedese) che codifica per la proteina APP (happswe). A seguito di tale mutazione questi animali mostrano dei livelli elevati di accumulo della proteina b- amiloide nel sistema nervoso centrale. All età di 12 mesi, i topi presentano aggregati b-amiloidi in ippocampo e corteccia (placche) insieme ad alterazioni cognitive da attribuire principalmente ad una disfunzione del lobo temporale mediano. Studio elettrofisiologico Gli esperimenti saranno condotti su preparati di corteccia e di ippocampo. Gli animali saranno anestetizzati e sacrificati per decapitazione, dopodiché il cervello verrà rimosso dal cranio al fine di ottenere fettine dello spessore di 0.25-0.30 mm, mediante un vibratomo. Registrazioni in patch clamp Le fettine verranno messe in una cameretta di perfusione posta sopra ad un microscopio ottico, provvisto di sistema di visualizzazione dei neuroni all infrarosso e videocamera per microfluorimetria. Le registrazioni elettrofisiologiche verranno condotte con la tecnica del patch clamp, in configurazione whole cell, mediante elettrodi di vetro. Le correnti cellulari verranno acquisite mediante un amplificatore Axopatch 1D fil- 2009 685
Sezione III: Attività per progetti trate a 1kHz, digitalizzate. Le misurazioni intracellulari si ottengono dializzando la cellula registrata. Ogni valore di fluorescenza verrà da una regione di interesse comprendente il corpo cellulare del neurone e rapportando le immagini alle 2 lunghezze d onda e corrette per la fluorescenza di background, rilevata da regioni prive di marcante fluorescente. I valori verranno trasformati utilizzando il metodo di Grynkiewicz. Studio comportamentale Il topo transgenico, dall età di 12 mesi, presenta aggregati b-amiloidi in ippocampo e corteccia insieme ad alterazioni cognitive. L esame del comportamento in compiti striato-dipendenti mostra che sviluppa delle risposte riconducibili ad automatismi motori. Il deficit cognitivo di natura dichiarativa, sia nei pazienti AD che nei modelli animali della patologia, è accompagnato da un incremento di memoria procedurale. Sia i processi attenzionali sia le operazioni raggruppate sono mediati dalle regioni pre-limbiche e infra-limbiche. Valuteremo, mediante test comportamentali dipendenti dall ippocampo e dalla corteccia prefrontale mediana, la flessibilità cognitiva e comportamentale in topi transgenici verso i rispettivi controlli. Indicatori valutazione I risultati della ricerca, verranno utilizzati per articoli scientifici da sottoporre a riviste. Tali dati potranno contribuire ad identificare nuovi marcatori precoci di malattia. Disegno dello studio Nella I Fase si effettuano esperimenti di registrazione in modo patch-clamp da neuroni piramidali della corteccia cerebrale e ippocampale di topi transgenici. Nella II, ci confermiamo il correlato elettrofisiologico con i dati comportamentali. Per lo studio comportamentale l animale viene introdotto in una gabbia cubica di plexiglas trasparente con pavimento costituito da una griglia metallica che permette la somministrazione di un lieve shock elettrico. Il giorno seguente l animale viene introdotto nella stessa gabbia ma in assenza di shock. Questo test viene utilizzato per studiare la funzionalità ippocampale. Gli animali con alterazioni delle aree PL/IL sono in grado di formare l associazione contesto-choc ma sono incapaci di estinguerla e viene considerata come un difetto di plasticità comportamentale e, di alterate funzioni esecutive. 686 2009