Applied Physics Laboratory University of Foggia Spettroscopia Raman e microscopia AFM di cheratinociti umani: modificazioni cellulari dopo esposizione a basse dosi di agenti xenobiotici G. Perna, M. Lasalvia, V. Capozzi Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Foggia, Viale L. Pinto - 71122 Foggia
Outline Sostanze xenobiotiche: HgCl 2 e pesticidi Modello cellulare: cheratinociti Metodi di indagine: microspettroscopia Raman e microscopia AFM Risultati su cellule fissate e viventi esposte a HgCl 2 Risultati su cellule fissate esposte a Chlorphyriphos e Deltametrina Risultati preliminari curve forza-distanza su cellule esposte a prodotto commerciale Conclusioni
Sostanze xenobiotiche composti che non vengono prodotti dal metabolismo degli organismi viventi Sono sintetizzati dall industria chimica: per la loro utilità nei processi produttivi industriali (catalizzatori, coloranti, polimeri, etc.) per incrementare la produzione agricola (pesticidi, fitofarmaci, concimi) per attività domestiche
Composti a base di mercurio (es. HgCl 2 ) HgCl 2 : presente in insetticidi, antisettici e disinfettanti
Pesticidi Prodotti chimici in grado di controllare, limitare, respingere o distruggere microrganismi considerati come nocivi Organofosfati: neutralizzano un enzima (acetilcolinaesterasi) fondamentale per il corretto funzionamento degli stimoli nervosi. Piretroidi: agiscono sui canali del sodio delle membrane nervose.
Esposizione a sostanze xenobiotiche: inalazione Atmosfera Atmosfera Campi coltivati Insediamento urbano e industriale
Esposizione a sostanze xenobiotiche: ingestione Emissione Ricaduta con la pioggia Atmosfera Insediamento urbano e industriale Campi coltivati Acque dolci e salate Acqua Trasformazione Animali d allevamento Consumatore Suolo Distribuzione e vendita
Esposizione a sostanze xenobiotiche: contatto Atmosfera Atmosfera Campi coltivati Insediamento urbano e industriale
Esposizione a sostanze xenobiotiche: limiti Per ciascuna sostanza esistono limiti di esposizione giornaliera accettabile: 0.01 mg Kg -1 peso corporeo giorno -1 ) (dose Effetti tossici hanno origine da alterazioni a livello cellulare strutture e funzioni cellulari possono essere alterate da modificazioni chimiche e morfologiche di componenti cellulari analisi su cellule in vitro Esposizione a basse concentrazioni ( 1 ordine di grandezza rispetto alla concentrazione citotossica)
Modello cellulare: cheratinociti Cheratinociti umani normali (linea primaria HUKE) Cellule in coltura in EpiLife medium a 37 C e 5% di CO 2 Esposizione per 24 h a diverse concentrazioni di xenobiotico Trypan blue Test colorimetrici MTT Concentrazione citotossica: provoca la morte di più del 50% del campione cellulare
Cellule viventi o cellule fissate? Fissazione Immersione in soluzione di paraformaldeide Formazione legami con proteine sulla membrana Cellula e componenti cellulari mantengono la loro morfologia anche in assenza delle condizioni chimico fisiche vitali Effetti fissazione: arresto dei processi vitali cellulari preservazione dei componenti cellulari contro processi di disgregazione.
Metodi di indagine: micro-spettroscopia Raman virtual state ƒ pump Raman Stokes excited state ground state Q.Matthews et al., Physics in Medicine and Biology 56, 19-38 (2011)
Metodi di indagine: microscopia AFM T. Puntheeranurak et al., Nature Protocols 6, 1443-1452 (2011)
Esposizione a HgCl 2 : Raman cellule fissate ~10-4 M concentrazione citotossica control treated with 10-6 M HgCl 2 treated with 10-4 M HgCl 2 Intensity (a.u.) 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Raman shift (cm -1 ) G. Perna et al., Journal Molecular Structure 834, 182-187 (2007) 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp; 1232 cm -1 : amide III ( sheet); 1262 cm -1 : amide III ( helix); 1287 cm -1 T, A (n.a.); 1302 cm -1 : CH 2 twisting (l); 1338 cm -1 : CH 2 twisting (p) + A, G (n.a.); 1379 cm -1 : A, G, T (n.a.).
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule fissate 10controllo -4 M HgCl 2 10-6 M HgCl 2 G. Perna et al., Journal Molecular Structure 834, 182-187 (2007)
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula prima dell esposizione a 10-7 M HgCl 2 4 3 line 1 y( m) 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 x( m)
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 15 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl 2 2.0 1.5 line 1 line 2 y( m) 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 x( m)
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 35 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl 2 1.8 line 1 y( m) 1.2 0.6 0.0 0 10 20 30 40 x( m)
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Cellula 55 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl 2 (a) 2.5 2.0 line 1 M. Lasalvia et al., Journal of Microscopy 243, 40-46 (2011) y( m) 1.5 1.0 0.5 0.0 (b) 0 10 20 30 40 50 x( m)
Esposizione a HgCl 2 : AFM cellule viventi Relazione diretta tra morfologia cellulare ed HgCl 2 sui cheratinociti ad una concentrazione di 100 nm ALTERAZIONE MORFOLOGIA CELLULARE non citotossica citotossica 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1 mm
Esposizione a pesticidi: vitalità cellulare Chlorphyriphos (organofosfato) 100 80 alive cells dead cells 100 80 Deltametrina (piretroide) alive cells dead cells HUKE cells ( %) 60 40 HUKE cells (%) 60 40 20 20 0 control 10-6 10-5 10-4 10-3 chlorpyriphos concentration (M) 0 control 10-6 10-5 10-4 2.5x10-4 deltamethrin concentration (M) Concentrazione citotossica (24h) ~10-3 M (Chlorphyriphos) ~2.5x10-4 M (Deltametrina)
Esposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman Cellule esposte a Chlorphyriphos intensity (a.u.) 1.2 0.8 0.4 protein control 10-6 M 10-5 M protein protein + DNA lipid + protein DNA protein 0.0 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Raman shift (cm -1 ) G. Perna et al., Applied Physics Letters 95 (8), 083701 (2009)
Esposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman Cellule esposte a Deltametrina Raman Intensity (a.u.) 1.2 0.8 0.4 protein control 10-6 M 10-5 M protein protein+dna lipid+protein DNA protein 0.0 1000 1200 1400 1600 1800 Raman wavenumber (cm -1 ) G. Perna et al., Vibrational Spectroscopy 57, 55-60 (2011)
Intensity (a.u.) Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman 0.4 0.2 0.0 1.2 0.8 0.4 0.0 1.2 0.8 0.4 0.0 (a) Deconvoluzione con funzioni Gaussiane 1000 1040 1080 1120 (b) 1000 1177 1206 1232 1032 1262 1302 1337 1379 1088 1412 1450 1123 1480 1200 1300 1400 1500 (c) 1552 1581 1615 1655 1680 1550 1600 1650 Raman shift (cm -1 1700 ) 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe; 1032 cm -1 : CH in-plane bending Phe; 1088 cm -1 : PO 2 - stretching (n.a.) + C-O, C-C stretching (p) + C-C stretching (l); 1123 cm -1 : C-N stretching (p); 1177 cm -1 : C-H bending Tyr; 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp; 1232 cm -1 : amide III ( sheet); 1262 cm -1 : amide III ( helix); 1302 cm -1 : CH 2 twisting (l); 1337 cm -1 : CH 2,, CH 3 wagging (p) + A, G (n.a.); 1379 cm -1 : A, G, T (n.a.); 1450 cm -1 : CH 2 /CH 3 scissoring (l.) + CH 2 bending (p.); 1480 cm -1 : A, G (n.a.); 1552 cm -1 : Trp; 1581 cm -1 : A, G (n.a.); 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp; 1655 cm -1 : amide I ( helix); 1680 cm -1 : amide I ( sheet)
0.5 Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Chlorphyriphos 0.4 0.3 0.2 0.1 (1615 cm -1 ) (1206 cm -1 ) (1000 cm -1 ) Singoli amminoacidi 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe 1206 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp intensity (a.u.) 0.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.3 0 (control) 10-6 10-5 (1655-1680 cm -1 ) (1220-1280 cm -1 ) 0 (control) 10-6 10-5 (1379 cm -1 ) (1581 cm -1 ) (1480 cm -1 ) Legami fra amminoacidi 1655-1680 cm -1 : amide I 1220-1280 cm -1 : amide III Acidi nucleici 1379 cm -1 : A, G, T 1581 cm -1 : A, G 1480 cm -1 : A, G L intensità di ciascun picco è normalizzata rispetto a quella del picco a 1450 cm -1 0.2 0 (control) 10-6 10-5 Chlorphyriphos concentration (M)
0.3 0.2 0.1 0.0 2.0 Esposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Deltametrina 0 (control) 10-6 10-5 (1615 cm -1 ) (1204 cm -1 ) (1000 cm -1 ) Singoli amminoacidi 1000 cm -1 : symmetric ring breathing Phe 1204 cm -1 : C-C 6 H 5 Tyr, Phe, Trp 1615 cm -1 : C=C, Tyr. Trp intensity (a.u.) 1.5 1.0 0.2 0.1 (1655-1680 cm -1 ) (1220-1280 cm -1 ) 0 (control) 10-6 10-5 (1056 cm -1 ) Legami fra amminoacidi 1655-1680 cm -1 : amide I 1220-1280 cm -1 : amide III Carboidrati 1056 cm -1 : C-C L intensità di ciascun picco è normalizzata rispetto a quella del picco a 1450 cm -1 0.0 0 (control) 10-6 10-5 Deltamethrin concentration (M)
Esposizione a pesticidi: misure AFM Chlorphyriphos Controllo: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori. 10-6 M and 10-5 M: forma regolare, nucleo compatto, superficie con lievi increspature rispetto al controllo G. Perna et al., J. Raman Spectroscopy 42, 603-611 (2011)
Esposizione a pesticidi: misure AFM Deltametrina Controllo:: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori. 10-6 M e 10-5 M: forma irregolare, membrana plasmatica danneggiata. G. Perna et al., Vibrational Spectroscopy 57, 55-60 (2011)
Curve forza-distanza modulo di Young E sforzo, deformazione F>0: repulsiva F<0: attrattiva La forza di interazione è descritta da relazioni analitiche dipendenti dalla forma della punta e dalle caratteristiche dei due materiali a contatto
Curve forza-distanza Dimensioni sonda ~nm => proprietà elastiche locali Dimensioni sonda ~µm => => proprietà elastiche globali Stima di E: modello di Hertz Forza di indentazione su un materiale elastico ed omogeneo: F 4 RC 3 1 E 2 3/ 2 δ: profondità di indentazione ν: coefficiente di Poisson R C : raggio della sonda E: modulo di Young
Esposizione a pesticidi: curve forza-distanza Prodotto commerciale: Deltametrina + coformulanti + solvente Vitalità cellulare Concentrazione citotossica (per 24 h): > 2.5 10-6 M L aggiunta di coformulanti diminuisce la concentrazione citotossica (~2 ordini di grandezza) Deflessione microleva (nm) 200 150 100 50 0 controllo 5X10-8 M 5X10-7 M -300-200 -100 0 100 200 spostamento piezoelettrico (nm) Curve forza-distanza indentazione = spostamento - deflessione 5x10-7 M diminuisce deflessione aumenta indentazione
Esposizione a pesticidi: calcolo modulo di Young F 4 RC E 2 3 1 3/ 2 F K, con K E 31 4 2 R C K 3/ 2 4 RC E 2 3 1 2 valori di K => 2 valori di E E 1 : indentazione minore di ~20 nm : regione membrana E 2 : indentazione maggiore di ~20 nm: regione citosol
Conclusioni Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori alla citotossica causa alterazioni biochimiche nelle cellule CHLORPHYRIPHOS basi del DNA, singoli aminoacidi, legami peptidici, legami lipidici di membrana HgCl 2 legami lipidici di membrana e acidi nucleici DELTAMETRINA legami -CH 2 dei lipidi delle citomembrane
Conclusioni Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori alla citotossica causa alterazioni morfologiche e meccaniche nelle cellule DELTAMETRINA Forma irregolare, formazione di fori e rigonfiamenti sulla membrana, riduzione del modulo di elasticità di membrana HgCl 2 Superficie irregolare, formazione di fori e rigonfiamenti sulla membrana HgCl 2 Azione immediata dell HgCl 2 provoca modificazioni della membrana plasmatica
Collaborazioni Vito Capozzi Marco Lazzarino Maria Lasalvia Elisa Migliorini Palma D Antonio Giuseppe Quartucci Emilio Mezzenga Antonio Cricenti Marco Luce