EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Codice K8010 5 a edizione Il kit contiene reagenti sufficienti per 400 600 test. Per Dako Autostainer/Autostainer Plus Reagenti facoltativi: Codice Nome prodotto Test K8004 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 200-430 K8005 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 200-430 K8006 EnVision FLEX Antibody Diluent 400-600 K8007 K8018 K8019 K8022 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+ Mouse (LINKER), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) 400-600 120-190 120-190 Altre opzioni K8020 FLEX IHC Microscope Slides 500 (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.1/11

Indice generale Pagina Uso previsto... 3 Cenni introduttivi... 3 Reagenti... 4 A. Materiali forniti... 4 B. Materiali necessari ma non forniti... 5 C. Reagenti facoltativi... 5 Precauzioni... 6 Conservazione... 6 Preparazione dei reagenti... 7 Raccolta e preparazione dei campioni... 7 Procedura... 8 A. Procedura di pretrattamento... 8 B. Procedura di colorazione... 9 Controllo della qualità... 10 Interpretazione dei risultati... 10 Limiti... 10 Spiegazione dei simboli... 11 (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.2/11

ITALIANO Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. Il sistema di rilevazione Dako EnVision FLEX è idoneo ad essere utilizzato nei test di immunoistochimica unitamente agli strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus. Il sistema rileva gli anticorpi primari di topo e di coniglio e visualizza la reazione mediante il prodotto EnVision FLEX DAB+ Chromogen. Se utilizzato con EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (codice K8019) o EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (codice K8022), è possibile ottenere un amplificazione del segnale degli anticorpi primari rispettivamente di topo o di coniglio. I reagenti EnVision FLEX sono idonei per essere utilizzati su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Cenni introduttivi Il sistema di rilevazione Dako EnVision FLEX è stato formulato per essere un sistema flessibile e fornisce una colorazione ottimale sugli strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus, quando si utilizza il protocollo consigliato in questo foglietto illustrativo. Prima della colorazione, è necessario che le sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina vengano sottoposte alla rimozione della paraffina e all idratazione, seguite dallo smascheramento termoindotto dell epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval) con il metodo di smascheramento dell epitopo specificato nel foglietto illustrativo dell anticorpo primario. Vedere anche la sezione Procedura per la preparazione dei campioni 3-in-1. Il codice K8010 comprende EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828). In alternativa, si consigliano EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (codice K8004) o EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (codice K8005). Alcuni anticorpi primari necessitano di un pretrattamento enzimatico del tessuto anziché di un trattamento HIER per assicurare una colorazione ottimale. È necessario bloccare la perossidasi endogena con EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (DM821) incluso nel kit. Vista l efficacia della procedura di lavaggio e la presenza di proteine stabilizzanti nei reagenti Dako, non sono necessarie fasi di bloccaggio extra per ridurre la colorazione aspecifica dello sfondo. Si consiglia di utilizzare EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831) incluso nel kit o disponibile quale reagente facoltativo (codice K8007). Gli anticorpi primari non sono forniti con il kit. Si consiglia di utilizzare Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies o Dako concentrated Primary Antibodies. Si consiglia di utilizzare EnVision FLEX Antibody Diluent (codice K8006) per la diluizione di Dako concentrated Primary Antibodies. EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (codice K8019) può essere applicato per un ottima amplificazione del segnale degli anticorpi primari di coniglio. Per l amplificazione del segnale quando si usano anticorpi primari di topo, può essere applicato EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (codice K8022 o incluso nel codice K8012) Come suggerimento: EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) fornisce un amplificazione del segnale di 2 3 volte, mentre EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) fornisce un amplificazione del segnale di 4 5 volte. Il reagente Dako EnVision FLEX /HRP detection reagent (DM822), contenuto nel kit, è costituito da una catena di destrano a cui si appaiano le diverse molecole di perossidasi di rafano (HRP) e dell anticorpo secondario. Per l appaiamento entra in gioco una speciale reazione chimica che consente il legame di un massimo di 100 molecole di HRP e un massimo di 20 molecole di anticorpo per ogni catena. Il sistema substrato contenuto nel kit è costituito da due componenti: EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827), soluzione concentrata di diaminobenzidina (DAB), e EnVision FLEX Substrate Buffer (DM823), tampone contenente perossido di idrogeno. Prima dell uso è necessario diluire EnVision FLEX DAB+ Chromogen in EnVision FLEX Substrate Buffer. Il sistema substrato genera un prodotto di colore marrone intenso nel sito dell antigene bersaglio. Per la colorazione di contrasto si consiglia di utilizzare EnVision FLEX Hematoxylin (codice K8018). Il reagente fornisce una colorazione del nucleo azzurro chiaro. È possibile montare le sezioni di tessuto colorate con un mezzo acquoso o un solvente organico. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.3/11

Reagenti A. Materiali forniti DM821 DM822 DM827 DM823 DM828 DM831 EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent 10 x 13 ml, pronto all uso Tampone fosfato contenente perossido di idrogeno, 15 mmol/l NaN 3 e detergente. EnVision FLEX/HRP 10 x 13 ml, pronto all uso Destrano appaiato a molecole di perossidasi e a molecole di anticorpo secondario di capra contro le immunoglobuline di coniglio e topo. In soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e conservante. EnVision FLEX DAB+ Chromogen 3 x 3 ml 3,3 -diaminobenzidina tetracloridrato in solvente organico. Il colore di questo reagente può variare da viola intenso a neutro senza incidere sulle prestazioni del kit. EnVision FLEX Substrate Buffer 20 x 13 ml Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno e conservante. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 9 x 30 ml, ad una concentrazione 50x Tampone Tris/EDTA, ph 9 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 4 x 1 L, ad una concentrazione 20x Soluzione salina tamponata-tris contenente Tween 20, ph 7,6 (±0,1). (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.4/11

B. Materiali necessari ma non forniti Strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (se necessario) Dako FLEX Ready-to-Use Primary Antibodies o anticorpi primari di coniglio o topo concentrati a marchio Dako opportunamente diluiti DakoFLEX Ready-to-Use Rabbit o Mouse Universal Negative Control o un reagente di controllo negativo equivalente per l anticorpo primario Utensili per strumenti Dako Vetrini per microscopio, per es. FLEX IHC Microscope Slides Reagenti generici di laboratorio per la rimozione della paraffina dalle sezioni di tessuto incluse in paraffina Mezzo di montaggio (acquoso o solvente organico) e vetrini coprioggetto C. Reagenti facoltativi K8004 DM828 K8005 DM829 K8006 DM830 K8007 DM831 K8018 DM826 K8019 DM825 K8022 DM824 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, ad una concentrazione 50x Tampone Tris/EDTA, ph 9 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 3 x 30 ml, ad una concentrazione 50x Tampone Citrate, ph 6.1 EnVision FLEX Antibody Diluent 120 ml, ready-to-use Tampone Tris, ph 7.2, contenente 15 mmol/l NaN 3 e proteina. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 1 L, ad una concentrazione 20x Soluzione salina tamponata-tris contenente Tween 20, ph 7.6 (±0,1). EnVision FLEX Hematoxylin 10 x 13 ml, pronto all uso Soluzione acquosa di ematossilina. EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) 3 x 13 ml, pronto all uso Soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico. EnVision FLEX+, Mouse (LINKER) 3 x 13 ml, pronto all uso Soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.5/11

Precauzioni 1. Per uso professionale. 2. EnVision FLEX /HRP, EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) e EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) contengono materiale di origine animale, pertanto non è possibile escludere la presenza di tracce di materiale umano lasciate durante il processo produttivo. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 3. Non esporre il prodotto EnVision FLEX DAB+ Chromogen EnVision FLEX Substrate Buffer o EnVision FLEX Substrate Working Solution a fonti di luce intensa durante la procedura. 4. Su richiesta, è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti per EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) e EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x). 5. Su richiesta, è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti per EnVision FLEX Wash Buffer (20x). 6. Su richiesta, è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti per EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent. 7. EnVision FLEX DAB+ Chromogen contiene 1 5% di 3,3 -diaminobenzidina tetracloridrato e riporta l etichetta: Nocivo. R40 Prove limitate di un effetto cancerogeno. R43 Può causare sensibilizzazione in caso di contatto con la cute. R68 Possibile rischio di effetti irreversibili. S35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S36/37 Indossare abbigliamento e guanti protettivi adeguati. Di norma, l utilizzo di questo prodotto non è consentito ai minori di 18 anni. Gli utenti devono essere accuratamente informati relativamente alla procedura di lavoro adeguata, alle proprietà pericolose del prodotto e alle istruzioni di sicurezza necessarie (secondo la Direttiva dell Unione Europea 94/33/EC). Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (Material Safety Sheet, MSDS) corrispondente. USA: 3,3 -diaminobenzidina (DAB) può essere nociva se inalata, a contatto con la cute e se ingerita. Il materiale è irritante per occhi e cute. Se tale sostanza entra a contatto con la cute, lavare l area interessata con sapone e acqua. NOTA: anche se la diaminobenzidina è strutturalmente correlata alla benzidina, non esiste alcuna prova della cancerogenicità della diaminobenzidina. Consultare le direttive federali, statali o locali per lo smaltimento. 8. Il reagente facoltativo EnVision FLEX Antibody Diluent (codice K8016) contiene sodio azide (NaN 3 ), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato come prodotto rischioso, il contenuto di sodio azide alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l eventuale accumulo di azide metallica. 9. Indossare dispositivi di protezione personale per evitare il contatto con la cute e gli occhi. 10. Una soluzione inutilizzata deve essere smaltita secondo le direttive locali, statali e federali. Conservazione Conservare i reagenti EnVision FLEX e EnVision FLEX+ ad un temperatura pari a 2 8 C. Conservare EnVision FLEX Hematoxylin (codice K8018) al buio a temperatura ambiente. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulle fiale. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall utente. Dopo la preparazione, conservare la Substrate Working Solution a 2 8 C, al buio e usarla entro 5 giorni. Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema del prodotto, contattare l Assistenza Tecnica Dako. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.6/11

Preparazione dei reagenti A.1 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (DM828, codice K8004) Diluire una quantità sufficiente di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) a un rapporto di 1:50 utilizzando acqua distillata o deionizzata per la procedura di colorazione pianificata. La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2 8 C per un mese. Se si usa Dako PT Link per il pretrattamento, è possibile eseguire la diluizione versando il contenuto della fiala di Target Retrieval Solution (50x) nel serbatoio Dako PT Link e aggiungendo acqua distillata o deionizzata fino alla linea contrassegnata (linea di riempimento). Eliminare la soluzione se appare torbida. Se abbinata a PT Link per la procedura di preparazione del campione 3 in 1, la soluzione diluita può essere utilizzata 3 volte nell arco di 5 giorni, a condizione che venga conservata a temperatura ambiente. A.2 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (DM829, codice K8005) Diluire una quantità sufficiente di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) a un rapporto di 1:50 utilizzando acqua distillata o deionizzata per la procedura di colorazione pianificata. Se si usa Dako PT Link per il pretrattamento, è possibile eseguire la diluizione versando il contenuto della fiala di Target Retrieval Solution (50x) nel serbatoio Dako PT Link e aggiungendo acqua distillata o deionizzata fino alla linea contrassegnata (linea di riempimento). La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2 8 C per un mese. Eliminare l a soluzione se appare torbida. Se abbinata a PT Link per la procedura di preparazione del campione 3 in 1, la soluzione diluita può essere utilizzata 3 volte nell arco di 5 giorni, a condizione che venga conservata a temperatura ambiente. A.3 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (DM831, codice K8007) Diluire una quantità sufficiente di EnVision FLEX Wash Buffer (20x) secondo un rapporto 1:20 utilizzando acqua distillata o deionizzata per la procedura di colorazione pianificata. Diluire aggiungendo il Wash Buffer concentrato in una quantità presmisurata di acqua distillata o deionizzata onde ridurre la formazione di schiuma. Mescolare delicatamente finché la soluzione diluita è omogenea. La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2 8 C per un mese. Eliminare la soluzione se appare torbida. Se abbinata a PT Link per la procedura di preparazione del campione 3 in 1, la soluzione diluita può essere utilizzata 3 volte nell arco di 5 giorni, a condizione che venga conservata a temperatura ambiente. A.4 EnVision FLEX Substrate Working Solution La EnVision FLEX Substrate Working Solution contenente DAB viene preparata miscelando con cura 1 goccia di EnVision FLEX DAB+ Chromogen (DM827) per 1 ml EnVision FLEX Substrate Buffer (DM823). Usare EnVision FLEX Substrate Working Solution entro 5 giorni (conservare al buio a 2 8 C). Raccolta e preparazione dei campioni I campioni possono essere delle sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. Il tempo di fissazione dipende dal fissativo e dal tipo/spessore di tessuto. Per esempio, i blocchi di tessuto con spessore di 3 4 mm devono essere fissati in formalina tamponata neutra per 18 24 ore. Lo spessore ottimale delle sezioni incluse in paraffina è di circa 4 µm. I campioni devono essere montati su vetrini per microscopio, per es. FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020). Montare le sezioni sui vetrini distendendole il più possibile, finché non risultano completamente lisce. I risultati della colorazione possono essere compromessi dalla presenza di un numero eccessivo di pieghe. NOTA: le dimensioni dei vetrini per microscopio devono essere adeguate ai requisiti dello strumento Dako Autostainer/Autostainer Plus in uso. Per una definizione dei vetrini per microscopio idonei, fare riferimento al manuale dell operatore dello strumento Dako in uso. Montare le sezioni in paraffina da un bagnomaria preriscaldato contenente acqua distillata o deionizzata. Il bagnomaria non deve contenere additivi quali gelatina, polilisina, ecc. Asciugare le sezioni a una temperatura in genere non superiore a 60 C per almeno 60 minuti. Per far sì che le sezioni aderiscano perfettamente ai vetrini, prima di avviare la fase di asciugatura rimuovere tutta l acqua intrappolata sotto. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.7/11

Procedura Gli strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus usano tecniche basate su diversi principi che assicurano risultati ottimali. Prima di eseguire i protocolli sullo strumento Dako Autostainer/Autostainer Plus, leggere attentamente il manuale dell operatore per lo strumento Dako specifico. Per garantire la riproducibilità dello smascheramento dell epitopo, si consiglia si caricare sempre completamente il contenitore dei vetrini. Tale operazione assicura un riscaldamento uniforme delle sezioni in ogni seduta. A. Procedura di pretrattamento Procedura consigliata per la preparazione del campione 3 in 1 utilizzando PT Link È possibile effettuare deparafinizzazione, reidratazione e usare la tecnica HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina servendosi della procedura di preparazione dei campioni 3 in 1. 1. Preparare una soluzione di lavoro diluendo la EnVision FLEX Target Retrieval Solution a un rapporto di 1:50 in acqua distillata o deionizzata. 2. Riempire i serbatoi PT Link con una quantità sufficiente di (1,5 L) di soluzione di lavoro sufficiente a ricoprire le sezioni di tessuto. 3. Impostare PT Link per preriscaldare la soluzione fino a raggiungere una temperatura di 65 C. 4. Immergere le sezioni di tessuto montate, fissate in formalina, e incluse in paraffina in EnVision TM FLEX Target Retrieval Solution preriscaldata (soluzione di lavoro) nei serbatoi PT Link quindi incubare per 20 40 minuti a 97 C. Il tempo di incubazione o ttimale dovrebbe essere determinato dall utente. 5. Lasciare raffreddare le sezioni in PT Link finché la temperatura non raggiunge 65 C. 6. Rimuovere ogni rack per vetrini Autostainer con i vetrini dal serbatoio PT Link e immergere immediatamente i vetrini in un vaso/serbatoio (per es. PT Link Rinse Station, codice PT109) contenente il tampone EnVision Wash Buffer (20x) diluito, a temperatura ambiente. 7. Lasciare i vetrini immersi nel tampone EnVision FLEX Wash Buffer (20x) diluito a temperatura ambiente, per 1 5 minuti. 8. Posizionare i vetrini su uno strumento Autostainer/Autostainer Plus e procedere con la colorazione. Le sezioni non devono essiccarsi durante il trattamento o durante la procedura di colorazione immunoistochimica. 9. Dopo la colorazione, si consiglia di eseguire le operazioni di disidratazione, schiarimento e montaggio permanente. NOTA: quando viene utilizzata su PT Link per la procedura di preparazione del campione 3 in 1, la soluzione Target Retrieval diluita e il tampone Wash Buffer diluito possono essere utilizzati 3 volte in un periodo di 5 giorni, se conservati a temperatura ambiente. Procedura HIER utilizzando PT Link Dopo la rimozione della paraffina e l idratazione con il tampone (acqua), le sezioni di tessuto devono essere sottoposte allo smascheramento termoindotto dell epitopo (HIER): 1. Preparare una soluzione di lavoro diluendo EnVision Target Retrieval Solution (50x) a un rapporto di 1:50 in acqua distillata o deionizzata. 2. Riempire i serbatoi PT Link con una quantità sufficiente di (1,5 L) di soluzione di lavoro sufficiente a ricoprire le sezioni di tessuto. 3. Impostare PT Link per preriscaldare la soluzione fino a raggiungere una temperatura di 65 C. 4. Deparaffinare manualmente e reidratare le sezioni di tessuto montate sul vetro dei vetrini. Per una migliore adesione del tessuto al vetrino, si consiglia l uso di vetrini silanizzati o rivestiti. 5. Immergere le sezioni di tessuto a temperatura ambiente in EnVision Target Retrieval Solution preriscaldata (soluzione di lavoro) quindi incubare per circa 20 40 minuti a 97 C. Il tempo di incubazione ottimale dovrebbe essere determinato dall utente. 6. Lasciare raffreddare le sezioni in PT Link finché la temperatura non raggiunge 65 C. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.8/11

7. Rimuovere ogni rack per vetrini dal serbatoio PT Link e immergere immediatamente i vetrini in un vaso/serbatoio (per es. PT Link Rinse Station, codice PT109) contenente il tampone EnVision FLEX Wash Buffer (20x) diluito, a temperatura ambiente. 8. Lasciare i vetrini immersi nel tampone EnVision FLEX Wash Buffer (20x) diluito a temperatura ambiente, per 1 5 minuti. 9. Posizionare i vetrini su uno strumento Dako Autostainer/Autostainer Plus e procedere con la colorazione. Le sezioni non devono essiccarsi durante il trattamento o durante la procedura di colorazione immunoistochimica. 10. Dopo la colorazione dei vetrini, montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso. NOTA: quando la procedura viene utilizzata su PT Link per HIER, la soluzione Target Retrieval diluita e il tampone Wash Buffer diluito possono essere utilizzati 3 volte in un periodo di 5 giorni, se conservati a temperatura ambiente. Procedura HIER utilizzando vaschette Coplin: Dopo la rimozione della paraffina e l idratazione con il tampone (acqua), le sezioni di tessuto devono essere sottoposte allo smascheramento termoindotto dell epitopo (HIER): 1. Immergere in un bagnomaria le vaschette per la colorazione contenenti la soluzione diluita EnVision FLEX Target Retrieval Solution (50x). 2. Riscaldare il bagnomaria e le vaschette riempite con la soluzione EnVision FLEX Target Retrieval Solution (soluzione di lavoro) a 95 99 C. Coprire le vaschette con i coperchi in modo da stabilizzare la temperatura e impedire l evaporazione. 3. Immergere le sezioni a temperatura ambiente nelle vaschette per la colorazione con la soluzione EnVision FLEX Target Retrieval Solution (soluzione di lavoro) precedentemente riscaldata. 4. Riportare la temperatura del bagnomaria e della soluzione EnVision FLEX Target Retrieval Solution a 95 99 C. Incubare per 20 ( ±1) minuti a 95 99 C. 5. Rimuovere tutta la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Lasciare i vetrini a temperatura ambiente nella soluzione EnVision FLEX Target Retrieval Solution per 20 (±1) minuti, in modo che si raffreddino. 6. Decantare la soluzione EnVision FLEX Target Retrieval Solution e lavare le sezioni con EnVision FLEX Wash Buffer (20x) diluito e a temperatura ambiente per 1 5 minuti. 7. Posizionare il cestello con le sezioni lavate in uno strumento Dako Autostainer/Autostainer Plus. Iniziare immediatamente la seduta di colorazione precedentemente programmata. NOTA: quando la procedura viene utilizzata su vaschette Coplin HIER, la soluzione Target Retrieval diluita e il tampone Wash Buffer diluito possono essere utilizzati 1 sola volta (monouso). Esistono alcuni epitopi che non tollerano il trattamento HIER e altri che necessitano di un pretrattamento enzimatico. Fare riferimento al foglietto illustrativo dell anticorpo primario Dako corrispondente. Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020). B. Procedura di colorazione Gli anticorpi FLEX Dako Ready-to-Use Primary Antibodies possono essere utilizzati con il sistema di rilevazione Dako EnVision FLEX+ su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Il foglietto illustrativo dell anticorpo primario concentrato fornisce le istruzioni sulla diluizione per gli anticorpi primari concentrati Dako. È necessario diluire gli anticorpi primari concentrati usando EnVision FLEX Antibody Diluent (DM830, codice K8006). I cicli di colorazione e i tempi di incubazione sono preimpostati nel software di Dako Autostainer/Autostainer Plus con i seguenti protocolli: Protocollo modello: FLEX_200 (200 µl volume da dispensare) o FLEX_300 (300 µl volume da dispensare) Autoprogramma per cicli di colorazione: (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.9/11

FLEX (protocollo FLEX) FLEX_Mo (protocollo FLEX+ Mouse (LINKER)) FLEX_Rb (protocollo FLEX+ Rabbit (LINKER)) La fase Extra deve essere impostata su tampone di lavaggio nei cicli di colorazione con 10 vetrini. La fase Extra deve essere impostata su none per cicli di colorazione con più di 10 vetrini. Ciò garantisce dei tempi di lavaggio confrontabili. Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Per dettagli, fare riferimento al manuale dell operatore relativo allo strumento dedicato. Se i protocolli non sono disponibili sullo strumento Dako Autostainer utilizzato, rivolgersi all Assistenza Tecnica Dako. I tempi di incubazione ottimali dell anticorpo primario e di EnVision FLEX /HRP dipendono dall anticorpo primario applicato. Fare riferimento al foglietto illustrativo dell anticorpo primario Dako corrispondente. L utente deve verificare il protocollo applicato. Al termine della procedura di colorazione, è necessario montare i campioni. Si consiglia di eseguire le operazioni di disidratazione, schiarimento e montaggio permanente se i vetrini sono stati trattati secondo la procedura di preparazione del campione 3 in 1. I vetrini trattati seconda la procedura HIER possono essere montati usando un mezzo di montaggio acquoso o permanente. Per il montaggio acquoso, si consiglia di utilizzare mezzi di montaggio quali Dako Glycergel Mounting Medium, codice C0563, o Faramount Aqueous Mounting Medium, codice S3025. Controllo della qualità Ogni seduta di colorazione dovrebbe includere un campione di controllo positivo noto per confermare che le prestazioni di tutti i reagenti siano adeguate. Se il campione di controllo positivo non produce una colorazione positiva, la marcatura dei campioni analizzati non può essere considerata valida. È necessario includere un reagente di controllo negativo con ogni campione per identificare l eventuale colorazione aspecifica. Se non è possibile distinguere la colorazione aspecifica dalla colorazione specifica, la marcatura dei campioni di analisi non può essere considerata valida. Interpretazione dei risultati La soluzione Substrate Working Solution contenente diaminobenzidina produce un colore marrone nel sito dell antigene bersaglio che viene riconosciuto dall anticorpo primario. Il colore marrone deve essere visibile nel campione di controllo positivo nel punto in cui è prevista la presenza dell antigene bersaglio. L eventuale colorazione aspecifica sarà di tipo marrone piuttosto diffuso e interesserà i vetrini sottoposti a trattamento con il reagente di controllo negativo. I nuclei risulteranno blu a causa della colorazione di contrasto a base di ematossilina. Limiti 1. Solo per uso automatizzato su strumenti Dako Autostainer. Quando si esegue la colorazione manualmente, la procedura ottimale va determinata e verificata a cura dell utente, salvo diverse indicazioni riportate nel foglietto illustrativo del Dako Primary Antibody specifico. 2. Usare solo su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Quando si usano sezioni congelate o strisci cellulari, la procedura ottimale va determinata e verificata a cura dell utente, salvo diverse indicazioni riportate nel foglietto illustrativo del Dako Primary Antibody specifico. Le variazioni della procedura possono influire sul numero di test forniti nel kit. (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.10/11

Spiegazione dei simboli Num ero di catalogo Lim iti di temperatura Data di sc adenza Dis positivo m edico diagnostico in vitro Contiene m ateriale per <n> test Produttore Consultare le is truzioni per l uso Codice batch Nocivo I sistemi Dako EnVision sono coperti dal Brevetto USA n. 5.543.332 e dal Brevetto Europeo n. 594.772. Prodotto da: Dako North America, Inc. Prodotto per: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danimarca Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (125091-001) P03909IT_01_K8010/2011.03.25 p.11/11