PREMIO TESI S.I.P.I. 2010 Aspetti veterinari e di sanità pubblica nell allevamento della tilapia (Oreochromis niloticus) in Kenia Veterinary and public health aspects in cultured tilapia (Oreochromis niloticus) from Kenya Francesco Turci 1,2, Andrea Gustinelli 2, Daniela Florio 2, MariaLetizia Fioravanti 2* 1 Corso di Laurea in Medicina Veterinaria, Facoltà di Medicina Veterinaria, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna; 2 Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna. SUMMARY - Aquaculture is a zootechnical sector in increasing expansion over the world which could be strategic for the economic and social advancement of developing countries, including the African continent. The European BOMOSA Project (Integrating BOMOSA cage fish farming systems in reservoirs, ponds and temporary water bodies in Eastern Africa) (2006-2009) intended to establish small scale fish farming in marginal water bodies in East African countries creating rural aquaculture networks with the aim to economically integrate aquaculture with agriculture. In the framework of the BOMOSA project, a study of veterinary and public health aspects in tilapia (Oreochromis niloticus) cultured in Bomosa fish farming systems has been carried out. The activities of the DVM thesis here summarized fall in this field and have been performed from October to December 2007 in Sagana Fish Farm, the main BOMOSA Kenyan hub. In this period a total of 160 tilapias have been sampled from 11 farm ponds and subjected to complete parasitological examination. In some cases, infected tissues were fixed in 10% buffered formalin for histology. Furthermore, in order to study the life cycle of some helminths recovered in the farmed fish, parasitological analyses were carried out on 72 gastropods owing to Bulinus and Melanoides genera, and 5 piscivorous birds (2 herons Ardea cinerea, 2 hammerkop Scopus umbretta and 1 cormoran Phalacrocorax carbo). This survey allowed to identify several protozoan, myxozoan and metazoan parasites which could be pathogenic to farmed fish and, in some case, to humans. The results of parasitological exams carried out on gastropods and piscivorous birds confirmed the presence of all the suitable hosts for a successful completion of the life cycle of several helminths recovered from farmed fish. Key words: Tilapia; Oreochromis niloticus; Parasites; Life cycle; Public Health; BOMOSA project; Kenya. * Corresponding Author: c/o Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Via Tolara di sopra, 50 40064 Ozzano dell Emilia (BO). Tel. 051-2097068; E-mail: marialeti.fioravanti@unibo.it. 77
INTRODUZIONE Nell ambito del progetto europeo Integrating BOMOSA cage fish farming system in reservoirs, ponds and temporary water bodies in Eastern Africa si è condotto uno studio sui fattori sanitari di carattere strettamente veterinario e di potenziale interesse in Sanità Pubblica che possono interessare l allevamento della tilapia (Oreochromis niloticus) in Kenya, Uganda ed Etiopia con particolare riferimento ai siti di produzione BOMOSA. Il progetto BOMOSA ha inteso sviluppare ed applicare sistemi di allevamento di tilapia (Oreochromis niloticus) in gabbia in bacini d acqua temporanei o marginali normalmente non utilizzati per altri scopi dalla popolazione. Tale produzione ittica, su piccola scala ed a basso investimento, è finalizzata al sostentamento di comunità locali situate nel territorio rurale dei paesi partner africani. I requisiti in base ai quali il sistema in gabbie BOMOSA è stato realizzato sono i seguenti: deve essere un sistema facile da gestire (massimo 2-3 persone per manipolare una gabbia); nessuna necessità di ricorrere a logistiche sofisticate per trasporto o conservazione del prodotto; produrre piccole quantità di pesce invece di produzioni elevate di difficile gestione; la comunità (scuole, piccoli allevatori, associazioni femminili) deve essere integrata e coinvolta con un ruolo primario nella gestione. BOMOSA rappresenta un sistema di allevamento ittico pioneristico su piccola scala da realizzare in Africa orientale mediante l istituzione di un network rurale di acquacoltura coordinato in un sistema hub & plot al fine di integrare economicamente l acquacoltura all agricoltura. L approvvigionamento di avannotti di tilapia da sottoporre ad allevamento nei plot è garantito dal coinvolgimento nel progetto di allevamenti (hub) che li producono, fornendoli ai plot (Figura 1a) e provvedendo all assistenza tecnica soprattutto durante le fasi di avviamento. Obiettivo finale era fornire le basi per un modello socio-economico volto a contribuire ad alleviare la povertà in Africa orientale fornendo fonti proteiche supplementari e guadagni addizionali alle comunità rurali presenti in Kenia, Etiopia ed Uganda. Nel progetto BOMOSA sono stati coinvolti tre paesi africani (Kenia, Uganda ed Etiopia) e tre paesi europei (Austria, Repubblica Ceca ed Italia). Per il nostro paese, UNIBO - Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale Laboratorio di Ittiopatologia è stato coinvolto primariamente nello studio degli aspetti di tipo veterinario e di sanità pubblica legati ai siti d allevamento BOMOSA. In tale ambito si è inserito il lavoro di questa tesi, con interesse specifico verso la parassitofauna delle tilapie allevate e prodotte all interno del principale hub keniota (Sagana Fish Farm), per verificarne la composizione (qualitativa e quantitativa), studiarne il ciclo biologico e definirne le implicazioni medico-veterinarie soprattutto in riferimento a possibili perdite produttive, lesioni istopatologiche nell ospite ed eventuali risvolti in Sanità Pubblica. MATERIALI E METODI L allevamento Sagana Fish Farm, fondato nel 1966 e gestito attualmente dal Ministry of Fisheries Development del Kenia, è localizzato nella Provincia Centrale, a 104 km da Nairobi. Consta di oltre 120 bacini in terra di dimensioni variabili, in cui vengono allevati, in coltura singola o policoltura, tilapie (Oreochromis niloticus), pesci gatto africano (Clarias spp.) e, in misura minore, altre specie d acqua dolce. In circa 40 di questi bacini vengono allevate tilapie in monocoltura (mono-sex e mista). 78
Nel periodo di indagine a Sagana Fish Farm (ottobre - dicembre 2007) sono stati esaminati 160 pesci, tutti appartenenti alla specie Oreochromis niloticus ed allevati in 11 diversi bacini in terra. L esame parassitologico delle tilapie è stato effettuato secondo i protocolli standard stilati da UNIBO appositamente per il progetto BOMOSA ed adottati nel corso delle attività di monitoraggio veterinario previste dal progetto. I parassiti protozoi reperiti nel corso dell indagine sono stati identificati sul posto, tramite osservazione a fresco al microscopio ottico, almeno a livello di famiglia o genere, mentre i parassiti myxozoa, elminti e crostacei sono stati fissati in etanolo al 70% per la loro successiva identificazione mediante chiarificazione e/o colorazione in laboratorio. L identificazione dei parassiti è stata effettuata mediante l uso di chiavi di identificazione tassonomica (Dawes, 1956; Ukoli, 1966; Kabata, 1970; 1985; Lom & Dyková, 1992; Hoffman, 1999; Scholz et al., 2004), nonché del manuale Parasites, infections and diseases of fishes in Africa. An update di Paperna (1996) e di specifici lavori scientifici. Nello stesso periodo d indagine, si è proceduto a condurre l esame parassitologico anche su 72 molluschi gasteropodi prelevati dagli stessi bacini da cui venivano prelevate le tilapie. Il campionamento veniva effettuato tramite setacciamento del fondale o raccolta con retino da plancton con maglia di 500 µm dalle sponde dei bacini. I gasteropodi, una volta identificati sulla base delle indicazioni di Pampiglione et al. (1988), venivano sottoposti a stress termico e luminoso per determinare l eventuale liberazione delle cercarie contenute ed esaminati quindi al microscopio ottico. Nel periodo di ricerca condotto a Sagana Fish Farm si è avuta inoltre la possibilità di esaminare cinque uccelli ittiofagi rinvenuti già deceduti nelle reti di protezione dell allevamento. L esame parassitologico si è rivolto esclusivamente alla ricerca di parassiti elminti gastro-intestinali al fine di indagare sul ruolo degli uccelli ittiofagi nella trasmissione di alcuni parassiti riscontrati nelle tilapie dell allevamento. In alcuni casi si è provveduto a fissare in formalina tamponata al 10% tessuti di gasteropodi, pesci ed uccelli parassitati per la successiva esecuzione dell esame istologico in laboratorio. Il calcolo dei valori di prevalenza, intensità di infestazione, intensità d infestazione media ed abbondanza è stato effettuato secondo le indicazioni di Bush et al. (1997). RISULTATI Indagine parassitologica su tilapie Delle 160 tilapie esaminate tra ottobre e dicembre 2007, 146 sono risultate positive per almeno un taxa parassitario. Qui di seguito vengono indicati col temine Black spot e con Eye flukes i parassiti Diplostomoidea allo stadio larvale rinvenuti rispettivamente a livello di cute/muscolo e di distretto oculare. In tabella 1 sono elencati i valori totali di prevalenza, intensità ed abbondanza di infestazione per ogni taxa parassitario reperito nei 160 soggetti esaminati. I risultati delle analisi parassitologiche hanno mostrato gradi di infestazione molto diversificati fra le tilapie provenienti dai diversi bacini, con alcune differenze anche nella composizione della parassitofauna, ad eccezione della costante presenza di alcuni parassiti, quali ad esempio Trichodina sp. ed eye flukes, riscontrati in tutti i bacini considerati. Il valore più alto di prevalenza è stato riferito in termini generali agli eye flukes (70%) seguiti dai ciliati del genere Trichodina (53,7%). Tutti gli altri parassiti hanno presentato valori di prevalenza <17%, con sporadici ritrovamenti di Ichthyophthirius multifiliis e larve di nematodi identificati come appartenenti al genere Contracaecum. 79
PARASSITI PREVALENZA INTENSITA' ABBONDANZA Protozoi Trichodina sp. 53,70% medio-bassa - Peritrichi sessili 11,88% 4,57 0,54 Cryptobia sp. 8,13% molto bassa - Trichodinella sp. 3,75% molto bassa - Ichthyobodo necator 3,75% molto bassa - Coccidi 3,30% alta - Ichthyophthirius multifiliis 1,88% molto bassa - Myxozoa Myxobolus sp. 14,38% medio-bassa - Sphaerospora sp. 3,13% molto bassa - Platyhelminthes Monogena Dactylogyroidea 10,63% 6,47 0,68 Platyhelminthes Digenea Black spot L 10,63% 1,82 0,19 Eye flukes L 70% 6,11 4,28 Euclinostomum sp. L 3,13% 1,4 0,04 Clinostomum spp. L 13,75% 7,9 1,08 Metacercarie n.i. 5,63% 1,22 0,07 Platyhelminthes Cestoda Amirthalingamia sp. L 16,88% 5,22 0,88 Nematoda Contracaecum sp. L 1,25% 2 0,02 Acanthocephala Acanthosentis sp. 6,88% 2,36 0,16 Crustacea Lamproglena sp. 6,88% 1,45 0,1 Legenda: (L = stadio larvale; n.i. = non identificata). Tabella 1 Valori di prevalenza, intensità ed abbondanza per ogni taxa parassitario reperito nelle 160 tilapie esaminate. Table 1 Prevalence, intensity and abundance values for each parasite taxa found in 160 tilapia examined. I valori di intensità d infestazione media (Numero parassiti/numero soggetti parassitati) più elevati sono stati invece correlati alle metacercarie di Clinostomum spp. (7,9 parassiti/ospite), seguito dai monogenei Dactylogyroidea (6,47), dagli eye flukes (6,11) e dalle larve di cestodi del genere Amirthalingamia (5,22). I valori di abbondanza (Numero parassiti/numero soggetti esaminati) calcolati confermano un ampia distribuzione degli eye flukes nella popolazione allevata, mentre gli altri parassiti hanno mostrato valori nettamente inferiori. Indagine parassitologica in molluschi gasteropodi Solo in cinque degli 11 bacini presi in considerazione è stato possibile reperire esemplari di molluschi gasteropodi. I 72 molluschi gasteropodi sottoposti ad esame parassitologico sono stati identificati come appartenenti al genere Bulinus (5 esemplari) e Melanoides (67 esemplari). Gli esemplari di Bulinus sono stati trovati solo in un bacino a livello della vegetazione perimetrale. 80
A B C D E F G H I Figura 1 A) - BOMOSA plot; B) - Sagana Fish Farm; C) - Black spot (freccia); D) - metacercaria Strigeidae isolata da black spot; E) - metacercaria di Clinostomum sp. incistata (freccia); F) - metacercaria di Tylodelphys sp. da camera anteriore dell occhio; G) - metacercarie excistate di Euclinostomum sp.; H) - furcocercarie da Melanoides sp.; I) - adulti di Clinostomum cutaneum in esofago di airone. Figure 1 A) - BOMOSA plot; B) - Sagana Fish Farm; C) - Black spot (arrow); D) - Strigeidae metacercaria from blach spot; E) - encisted Clinostomum sp. metacercaria (arrow); F) - Tylodelphys sp. metacercaria from eye anterior camera; G) - Euclinostomum sp. excisted metacercariae; H) - furcocercariae from Melanoides sp.; I) - Clinostomum cutaneum adults in oesophagus of heron. 81
Sedici soggetti (22,2%) sono risultati positivi per forme larvali (sporocisti e cercarie) di digenei. In particolare sono stati evidenziati tre tipi di cercaria: furcocercarie, lofocercarie e xiphidiocercarie. Ci si è soffermati soprattutto sullo studio morfologico delle furcocercarie, in quanto descritte come possibili forme larvali di digenei Clinostomatidae e Diplostomoidea. Esse sono state osservate soprattutto nei gasteropodi del genere Melanoides raccolti nel bacino C2, dove peraltro i valori di prevalenza di eye flukes e di Clinostomum spp. erano particolarmente elevati (rispettivamente 73,3% e 40%). Negli altri gasteropodi erano presenti solo le altre due tipologie di cercaria sopra menzionate. Da un punto di vista delle loro caratteristiche morfologiche, le furcocercarie da noi reperite sono state ascritte al gruppo delle longifurcate, caratteristica che, unitamente all assenza di macchie oculari, le potrebbe far riferire all ordine Diplostomoidea. Nei digenei clinostomatidi le furcocercarie sono invece ascrivibili alla tipologia brevifurcata (Hoffmann, 1999). Non è stato possibile condurre sul campo ulteriori osservazioni su caratteristiche morfologiche (es. spinulazione, papille, conformazione di faringe ed intestino, cellule a fiamma, ecc.) utili ad una più precisa identificazione delle cercarie reperite. L esame istologico condotto su alcuni gasteropodi parassitati ha permesso di individuare massive infestazioni a carico della ghiandola viscerale, con occasionali localizzazioni a livello delle gonadi e del piede. Il riscontro di sporocisti e cercarie di digenei in oltre il 22% dei gasteropodi esaminati rappresenta un dato di rilievo in quanto in genere le percentuali di positività riportate in letteratura sono nettamente inferiori. La presenza di stadi larvali di digenei in una percentuale così elevata di gasteropodi indica senz altro un elevata colonizzazione di parassiti digenei nell ambiente in studio, come dimostrato dai risultati degli esami parassitologici condotti sulle tilapie. In particolare nel bacino C2, dove si sono riscontrate l intensità e la percentuale di positività più elevate nei gasteropodi, anche i pesci presentavano frequenti ed abbondanti infestazioni da digenei Diplostomoidea e Clinostomatidi, al contrario di quanto evidenziato nelle tilapie provenienti dal bacino E4, dove non si è riscontrata alcuna positività nei gasteropodi raccolti. Indagine parassitologica in uccelli ittiofagi Nel periodo di indagine sono stati sottoposti ad esame parassitologico alcuni uccelli ittiofagi reperiti già deceduti in seguito ad intrappolamento nelle reti di protezione presenti intorno all allevamento e sopra alcuni bacini sperimentali. Sono stati esaminati in particolare 2 umbrette (Scopus umbretta), 2 aironi cenerini (Ardea cinerea) ed un cormorano (Phalacrocorax carbo). Nel corso dell esame parassitologico condotto sull apparato gastro-enterico sono state isolate forme adulte di parassiti digenei, nematodi e cestodi, in seguito identificati come appartenenti rispettivamente al genere Clinostomum, Contracaecum ed Amirthalingamia sia dagli aironi che dal cormorano, mentre i due soggetti di umbretta sono risultati negativi. Negli aironi sono state individuate due diverse specie di Clinostomum: Clinostomum phalacrocoracis e Clinostomum cutaneum. Gli adulti di Clinostomum cutaneum erano presenti a livello del primo tratto esofageo subito al di sotto del faringe e si presentavano in ammassi di individui aggregati in aree limitate della mucosa, mentre gli esemplari di Clinostomum phalacrocoracis erano in numero limitato e sparsi lungo tutto il tratto esofageo. Nel punto di attacco dei parassiti alla mucosa esofagea si rilevava la presenza di piccole ulcere circondate da un alone iperemico. 82
I parassiti nematodi appartenenti al genere Contracaecum reperiti sia in airone sia in cormorano, sono stati rinvenuti liberi nel lume gastrico ed intestinale dell ospite. I due esemplari del cestode A. macracantha reperiti rispettivamente in un airone ed un cormorano, raggiungevano 10 cm di lunghezza ed erano saldamente attaccati alla mucosa intestinale. Nel punto di attacco del cestode alla mucosa si notava una reazione nodulare sviluppatasi intorno allo scolice del parassita. In base ai reperti parassitologici ottenuti dall esame degli uccelli ittiofagi è stato possibile porre in relazione tutti i parassiti reperiti con diversi stadi larvali parassitari di frequente ricontro nelle tilapie dell allevamento (digenei del genere Clinostomum, nematodi del genere Contracaecum e cestodi del genere Amirthalingamia). Gli uccelli ittiofagi si sono quindi confermati importanti serbatoi di agenti parassitari della tilapia d allevamento. CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE Sulla base dei risultati delle attività di ricerca condotte nel corso della presente tesi sulle tilapie allevate presso l allevamento Sagana Fish Farm, la parassitofauna ha mostrato, in senso qualitativo e quantitativo, caratteri in linea con i dati riportati in letteratura per lo stesso ospite e gli stessi areali geografici (Paperna, 1996). Da un punto di vista strettamente veterinario, di particolare interesse appaiono le parassitosi sostenute da agenti a ciclo diretto quali i protozoi ciliati e flagellati, i monogenei ed i crostacei copepodi. Inoltre, sempre fra i parassiti monoxeni potenzialmente patogeni per l ospite pesce, vanno citati i coccidi del genere Goussia, reperiti sporadicamente, ma con alte intensità d infezione nella vescica natatoria delle tilapie sottoposte ad indagine parassitologica. Per queste parassitosi numerosi fattori ambientali e gestionali possono rappresentare elementi favorenti l insorgenza di vere e proprie malattie parassitarie in grado di causare perdite produttive e, in taluni casi, episodi di mortalità (Michel, 1989). Infatti le infezioni da protozoi ectoparassiti sono influenzate da parametri dell acqua non ottimali (ph, ammoniaca, bassi ricambi d acqua, alti livelli di carico organico, ecc.) e da condizioni di sovraffollamento, richiedendo quindi una particolare attenzione verso questi fattori nell ambito di programmi di prevenzione e controllo. La densità della biomassa rappresenta in generale un fattore determinante anche nella trasmissione di ectoparassiti monogenei e di coccidi a trasmissione oro-fecale, come ad esempio Goussia cichlidarum. Va quindi tenuto presente che in condizioni d allevamento in gabbia si potrebbero estrinsecare malattie parassitarie sostenute da questi agenti parassitari qualora dovessero essere introdotti avannotti parassitati e le condizioni ambientali dovessero risultare favorevoli alla colonizzazione, replicazione e trasmissione dei parassiti. Per quanto concerne le infestazioni da stadi larvali di elminti, quali in particolare le metacercarie di digenei Diplostomoidea e Clinostomatidi, i plerocerchi di cestodi Gryporhynchidae del genere Amirthalingamia e le larve di nematodi del genere Contracaecum spp., queste sono state evidenziate in quasi tutti i bacini in terra, talvolta con elevati valori di prevalenza ed intensità d infestazione. In questo caso numerosi fattori biotici, quali la presenza di invertebrati e di uccelli ittiofagi, possono rappresentare un importante fattore di rischio da tenere in considerazione nei programmi di monitoraggio ambientale e di prevenzione delle parassitosi all interno dei siti produttivi. In particolare, le analisi condotte nel periodo d indagine su gasteropodi ed uccelli ittiofagi presenti in allevamento hanno rilevato diffuse infestazioni sostenute da stadi larvali di digenei (nei gasteropodi) e da adulti di clinostomatidi del genere Clinostomum, nematodi del genere Contracaecum e cestodi del genere Amirthalingamia (in aironi e cormorani), 83
indicando come il ciclo biologico di questi parassiti possa realizzarsi con successo nell ambiente in studio per la presenza di tutti gli ospiti intermedi e definitivi idonei. Per quanto riguarda gli aspetti di Sanità Pubblica correlabili agli agenti parassitari individuati nel corso dell indagine, solo i digenei clinostomatidi del genere Clinostomum ed i nematodi anisakidi del genere Contracaecum potrebbero rappresentare un fattore di rischio per l uomo nel caso in cui prodotti ittici parassitati venissero consumati crudi o poco cotti. Sebbene nelle aree in studio le tilapie vengano in genere consumate cotte, non si può ignorare la possibile esistenza di abitudini alimentari che prevedono il consumo di pesce crudo a livello di comunità locali. Le attività di ricerca condotte nell ambito di questa tesi nell allevamento Sagana Fish Farm, principale hub fornitore di avannotti per il ripopolamento dei siti di allevamento in gabbia BOMOSA in Kenia, hanno permesso di individuare numerosi agenti parassitari potenzialmente patogeni per le tilapie allevate e, in alcuni casi, potenzialmente patogeni per l uomo. I piani di monitoraggio ambientale e le attività di gestione dell allevamento di tilapia in questo sito produttivo dovranno quindi prevedere azioni di controllo sanitario e procedure di monitoraggio dei fattori abiotici e biotici che possono influenzare l emergenza delle malattie parassitarie. RINGRAZIAMENTI Si ringrazia l Università di Bologna per aver finanziato la borsa di studio che mi ha permesso di svolgere un periodo di ricerca in Kenya per la conduzione della parte sperimentale della mia tesi di laurea in Medicina Veterinaria. Si ringrazia inoltre tutto il personale di Sagana Fish Farm per la collaborazione offerta nel corso delle attività di studio e ricerca condotte presso la loro azienda. BIBLIOGRAFIA Bush A.O., Lafferty K.D., Lotz J.M. & Shostak A.W. (1997). Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al. revisited. J. Parasitol., 83: 575-583. Dawes B. (1956). The Trematoda. Cambridge University Press, London. Hoffman G.L. (1999). Parasites of North American freshwater fishes. Cornell University Press, Ithaca USA: 1-539. Kabata Z. (1970). Diseases of fishes: book I. Crustacea as enemies of fishes. New Jersey: T.F.H. Publications. Kabata Z. (1985). Parasites and diseases of fish cultured in the tropics. Taylor & Francis, London & Philadelphia. Lom J. & Dykovà I. (1992). Protozoan parasites of fishes. In: Developments in Aquaculture and Fisheries Science, Elsevier, Amsterdam: 1-315. Michel C. (1989). Pathology of tilapias. Aquatic Living Resources, 2: 117-126. Pampiglione S., Toffoletto F. & Canestri-Trotti G. (1988). I molluschi di interesse parassitologicoveterinario in Italia. Ann. Ist. Super. Sanità, 24 (Supplemento): 1-105. 84
Paperna I. (1996). Parasites, infections and diseases of fishes in Africa - an update. FAO CIFA Technical Paper, 31: 1-220. Scholz T., Bray R.A., Kuchta R. & Řepová R. (2004). Larvae of gryporhynchid cestodes (Cyclophyllidea) from fish: a review. Folia Parasitologica, 51: 131-152. Ukoli F.M.A. (1966). On Clinostomum tilapiae n. sp. and C. phalacrocoracis Dubois, 1931 from Ghana, and a discussion on the systematics of the genus Clinostomum Leidy, 1856. J. Helminthol., 40, 1-2: 187-214. Tesi 2 a classificata al Premio SIPI 2010 85