L endocitosi dell EGFR IFOM per la scuola Lo Studente Ricercatore 2011 Muzio Giulia Istituto d Istruzione Superiore Maserati Voghera Gruppo di lavoro: Determinanti della trasformazione neoplastica e della progressione tumorale Nome tutor: Giusi Caldieri
Ad ogni recettore il suo ligando: EGFR con l EGF L EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) è un recettore di membrana coinvolto in vari processi biologici, tra cui migrazione, adesione e proliferazione delle cellule. L EGFR viene attivato grazie al suo ligando specifico, ovvero l EGF.
Cosa succede dopo l attivazione? A seguito del legame con EGF, il recettore: va incontro a una variazione conformazionale dimerizza, ovvero si lega a un altro complesso EGFR-EGF si autofosforila viene internalizzato nella cellula Il processo tramite cui la cellula internalizza molecole o corpuscoli presenti nello spazio extracellulare è chiamato endocitosi.
Il ruolo della membrana nell endocitosi Modificato da: Human Physiology (IPHY 3404) University of Colorado at Boulder Per permettere l internalizzazione delle molecole, la membrana plasmatica si curva per racchiudere in una vescicola le molecole da internalizzare. Questa vescicola viene convogliata nel citoplasma tramite i microtubuli.
L EGFR è internalizzato sempre nello stesso modo? L EGFR può essere internalizzato attraverso due vie: CME Clathrin-Mediated Endocytosis È la via sinora meglio caratterizzata, in cui la clatrina, proteina di rivestimento della membrana, media l endocitosi. NCE Non-Clathrin Endocytosis Non è conosciuta a livello molecolare. Si sa però che la clatrina non gioca un ruolo determinante.
L importanza della concentrazione dell EGF La CME si attiva già a basse dosi di EGF (1 mg/ml). La NCE si attiva solo con alte dosi di EGF (100 mg/ml). Modificata da: Sigismund et al., Cell 2008
Cosa comporta seguire CME o NCE? CME NCE Recycling Signalling Degradation Ritorno del recettore alla membrana plasmatica Tramissione di segnali che influenzano la cellula Degradazione del recettore
CME e NCE Vitali per la cellula, ma attenzione Il signalling attivato durante la CME è un segnale di sopravvivenza per le cellule. Un eccessiva stimolazione, però, può provocare il cancro. Alcuni tumori, infatti, sono caratterizzati da un aumentata attività dell EGFR nel tessuto tumorale. La NCE, invece, diminuisce la quantità di EGFR promuovendone la degradazione. Quindi può avere una funzione protettiva.
Importanza dello studio sulla NCE Controllare l attività dell EGFR promuovendone la degradazione a seguito dell internalizzazione tramite NCE potrebbe essere un approccio molecolare valido nella terapia contro il cancro. A tal fine bisogna: trovare le proteine coinvolte nella NCE verificare che le proteine in esame svolgano un ruolo nell endocitosi dell EGFR verificare quindi che siano presenti nelle vescicole internalizzate durante l endocitosi
Alcune delle proteine coinvolte in NCE: i reticulon Tramite esperimenti di screening, tra le proteine convolte in NCE sono stati identificati i reticulon. I reticulon sono proteine normalmente associate al reticolo endoplasmatico che, grazie alla loro forma, sono in grado di curvare la membrana. Tratto da: Bauer and Pelkmans, FEBS Letters 2006 Nelle cellule Hela (cellule tumorali umane immortalizzate) sono espresse 4 isoforme di reticulon (proteine differenti codificate dallo stesso gene): A, B, C, D.
Come verificare la presenza dei reticulon nelle vescicole? I reticulon possono essere localizzati tramite esperimenti di immunofluorescenza, ovvero una tecnica che permette di visualizzare una specifica proteina tramite l associazione di un anticorpo specifico coniugato con un colorante fluorescente. Modificata da: LaCellula.net
Di cosa ho bisogno per fare l immunofluorescenza? Per fare l immunofluorescenza servono quindi due anticorpi: un anticorpo primario che riconosca i reticulon un anticorpo secondario coniugato ad una molecola fluorescente che riconosca il primario Ogni anticorpo prima di poter essere utilizzato negli esperimenti deve essere validato. Recentemente dal laboratorio giapponese Tagaya è stato mandato un anticorpo anti-reticulon. Per vedere se riconosce effettivamente i reticulon bisogna validarlo.
Come validare l anticorpo anti-reticulon? Bisogna fare l immunofluorescenza in due campioni: cellule di controllo cellule in cui l espressione dei reticulon è stata inibita con la tecnica dell RNA interference (RNAi). La RNAi è una tecnica usata per silenziare un particolare mrna, inducendone la degradazione. In questo modo, la proteina non può essere tradotta.
Validazione di un anticorpo: cosa mi aspetto dall immunofluorescenza? L anticorpo risulta specifico, quindi valido, se: l immunofluorescenza su cellule di controllo, ovvero su cui non sono stati effettuati trattamenti, dà un segnale l immunofluorescenza su cellule trattate con RNAi per i reticulon dà un segnale molto debole o assente. L RNAi infatti silenzia i reticulon e, se l anticorpo è specifico, il segnale deve essere molto lieve.
I risultati dell immunofluorescenza: coincidenti con le aspettative Nelle figure vi sono i risultati dell immunofluorescenza con l anticorpo anti-reticulon in cellule di controllo e in cellule trattate con RNAi per i reticulon: nelle prime il segnale è chiaramente più forte che nelle seconde. Cellule di controllo Cellule trattate con sirna
L anticorpo inviato dal Giappone è valido? Gli esperimenti effettuati dicono di SÌ Basandoci sui risultati ottenuti possiamo affermare che l anticorpo anti-reticulon mandato dal laboratorio giapponese Tagaya è specifico per il riconoscimento dei reticulon: potrà essere utilizzato in futuro per esperimenti di colocalizzazione tra reticulon ed EGFR potrà quindi essere utile a caratterizzare la NCE