ZytoLight SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe Z-2124-200 20 (0.2 ml) Z-2124-50 5 (0.05 ml) Per la rilevazione della traslocazione che coinvolge il gene ALK a 2p23 mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC
Sonda polinucleotide marcata in fluorescenza per il rilevamento della traslocazione del gene ALK a 2p23. Pronto all uso. Descrizione Prodotto: Contenuto: Prodotto: Specificità: Stabilità/Conservazione: Sonda ZytoLight ALK Dual Color Break Apart Probe (PL81) in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi coniugati con un fluorocromo verde (ZyGreen, analogo alla FITC, eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm) che marca la sequenza mappata in 2p23 prossimale della regione di rottura del gene ALK e polinucleotidi coniugati con un fluorocromo arancio (ZyOrange, analogo alla Rodamina, eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm) che marca la sequenza mappata in 2p23 distale della regione di rottura del gene ALK. Z-2124-200: 0.2 ml (20 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) Z-2124-50: 0.05 ml (5 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) La sonda ZytoLight ALK Dual Color Break Apart Probe (PL81) è progettata per rilevare la traslocazione che interessa il gene ALK in 2p23 in tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina tramite ibridazione in situ fluorescente. La sonda ZytoLight ALK Dual Color Break Apart Probe (PL81) deve essere stoccata a -16/-22 C al buio ed è stabile fino alla data indicata sull etichetta.
Utilizzo: Precauzioni: Questo prodotto è un dispositivo per uso diagnostico in vitro (in base alle direttive EU 98/79/EC). L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da personale qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. Leggere il manuale d uso prima dell utilizzo! Non usare i reagenti dopo la data di scadenza riportata sull etichetta. Questo prodotto contiene sostanze (in piccoli volumi e piccole concentrazioni) dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Prendere le appropriate misure protettive (guanti monouso, occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio). Se i reagenti vengono in contatto con la pelle lavare abbondantemente con acqua. Principio del Metodo: La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex (con la sequenza cromosomiale 2p23 presente nel campione) può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati
Istruzioni: Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post fissazione) piuttosto che l allestimento del campione dovrebbero essere ottimizzati dall utilizzatore a seconda della natura del campione e dei propri bisogni. Denaturazione e ibridazione 1. Utilizzare 10µl di ZytoLight ALK Dual Color Break Apart Probe (PL81) per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino copri oggetto (22 mm x 22 mm a seconda della dimensione del campione). Sigillare il vetrino copri oggetto con fixogum o con colla analoga. 3. Denaturare a 75 C (± 2 C) per 10 minuti utilizzando una piastra calda La temperatura di denaturazione può dipendere da vari fattori come la fissazione o l età del campione pertanto potrebbe essere necessaria l ottimizzazione di tale temperatura (73 C-77 C) 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C in una stufa ventilata E importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante l ibridazione E possibile condurre le fasi di denaturazione/ibridazione mediante l utilizzo di piastre a controllo automatico della temperatura come il ThermoBrite StatSpin.
Risultati Mediante l utilizzo di filtri appropriati, i segnali di ibridazione della regione cromosomiale marcata 2p23 appariranno verdi e arancio. In interfase, le cellule normali o le cellule senza la traslocazione che coinvolge la banda 2p23 si distingueranno due segnali verde ed arancione fusi insieme. Un locus 2p23 colpito da traslocazione presenterà due segnali, verde e arancione, separati tra loro. Al fine di valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere effettuata assieme a dei controlli. Si consiglia l utilizzo di almeno un campione in cui lo stato di 2p23 sia noto. Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene. A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.
Bibliografia Inamura K, et al. (2009) Mod Pathol 22: 508-15. Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: 134-6. Koivunen JP, et al. (2008) Clin Cancer Res 14: 4275-83. Martelli MP, et al. (2009) Am J Pathol 174: 661-70. Palmer RH, et al. (2009) Biochem J 420: 345-61. Perner S, et al. (2008) Neoplasia 10: 298-302. Rodig SJ, et al. (2009) Clin Cancer Res 15: 5216-23. Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992)ISBN 0 19 963327 4. Ultima versione: 15 Novembre 2011 (4.5) Marchi di fabbrica: ZytoVision e ZytoLight sono marchi di fabbrica della ZytoVision