1 BIOTECNOLOGIE CELLULARI modulo di Tecniche Cellulari Vegetali 2 Coltura dei protoplasti, formazione di cellule Coltura delle cellule in liquido, calli in solido ed eventuale differenziazione
3 - scelta del tipo di espianto (tipicamente foglia) - caratteristiche dell espianto per la successiva rimozione dell epidermide - scelta della miscela enzimatica appropriata per l isolamento dei protoplasti - rimozione dell epidermide - pre-plasmolisi dei tessuti - digestione enzimatica - sospensione e lavaggio protoplasti - stima del numero di protoplasti isolati per ml - messa in coltura 4 - scelta del tipo di espianto (tipicamente foglia)
5 - caratteristiche dell espianto per la successiva rimozione dell epidermide Tabacco foglia con tricomi Pisello foglia glabra 6 - scelta della miscela enzimatica appropriata per l isolamento dei protoplasti Classi di enzimi impiegati: cellulasi (digestione parete cellulare) pectinasi (digestione lamella mediana) Fonte degli enzimi impiegati: funghi cellulosolitici (Trichoderma, Aspergillus) altre specie (batteri, lumache (elicasi)) Grado di purezza degli enzimi impiegati
7 - scelta della miscela enzimatica appropriata per l isolamento dei protoplasti Composizione della parete cellulare Monocotiledoni Dicotiledoni Cellulosa x x Emicellulose Xyloglucani x x Glucoarabino- x xylani Pectine x x Acidi fenolici x Glico-Proteine x x 8 - scelta dell'appropriata osmolarità del mezzo di coltura
9 - rimozione dell epidermide La rimozione dell epidermide è necessaria per consentire agli enzimi di penetrare tra le cellule dei tessuti e procedere alla digestione delle lamelle mediane e delle pareti cellulari. A tal fine, l epidermide deve: o essere rimossa completamente, col peeling; o essere incisa, attraverso il brushing o il taglio dell espianto in sezioni sottili. 10 Rimozione dell'epidermide col peeling
11 Rimozione dell'epidermide col brushing pennello a setole medie carburo di silicio (80-120) 12 Sterilizzazione degli enzimi: impiegare la filtro-sterilizzazione con filtri di Teflon, porosità 0,2 µm; filtro-sterilizzare con beuta da vuoto (monouso o in vetro) o, per piccoli volumi, con filtro su siringa; tenere presente i problemi di viscosità della soluzione
13 Sterilizzazione dei substrati: a causa della presenza nei substrati (plasmolisi, sospensione, flottaggio, coltura) di elevate concentrazioni di monosaccaridi, la sterilizzazione a vapor umido in autoclave è sconsigliata per evitare la caramellizzazione degli zuccheri e, comunque, la variazione della disponibilità dei nutritivi. Quindi, anche per questi substrati, è necessario impiegare la filtrosterilizzazione con filtri di porosità di 0,2 µm. 14 - composizione mezzo di plasmolisi generico: - Macro- e micro-elementi di Gamborg-B5 - Mannitolo 0,5 M (varia secondo specie e tessuto) - CaCl 2 1 gl -1 Tempo di plasmolisi: c.a 30 minuti - 1 ora Con la plasmolisi si permette alle cellule di adattarsi alla pressione osmotica generata dal monosaccaride e di prepararsi alla digestione enzimatica, distaccando il plasmalemma dalla parete cellulare
15 16 - composizione mezzo di digestione generico: - Macro- e micro-elementi di Gamborg-B5 - Mannitolo 0,5 M (varia secondo specie e tessuto) - Cellulasi 15 gl -1 - Macerozyme 3 gl -1 - CaCl 2 1 gl -1 - Ormoni (generalmente, una citochinina) Tempo di digestione: c.a 16 ore Con Pectolyase, anche solo 2-4 ore
17 Isolamento dei protoplasti 18 Isolamento dei protoplasti - sospensione e lavaggio protoplasti Protoplasti di pisello dopo isolamento in mezzo di sospensione
19 - composizione mezzo di sospensione generico: - Macro- e micro-elementi di Gamborg-B5 - CaCl 2 1 gl -1 - Un flottante, quale Saccarosio (0,5 M) o Percoll (è un sol composto da particelle di silicio rivestite di uno strato molto tenace di PVP - polyvinylpirrolidone disperse in acqua; in questo caso è necessaria l aggiunta di Mannitolo 0,5 M) Tempo: pochi minuti, richiesti per la centrifugazione a 1.000 rpm 20 Separazione di sub-popolazioni di protoplasti di pisello in gradiente di Percoll
21 Protoplasti di pisello in sospensione (Percoll 0%) 22 Protoplasti di pisello in sospensione (Percoll 10%)
23 Protoplasti di pisello in sospensione (Percoll 15%) 24 Protoplasti di pisello in sospensione (Percoll 30%)
25 Protoplasti di pisello in sospensione (Percoll 40%) 26 Selezione dei protoplasti attraverso citofluorimetria a flusso (cell sorting)
27 Selezione dei protoplasti attraverso citofluorimetria a flusso (cell sorting) Identificazione del gene codificante la α-1,3-mannosiltransferasi (ALG3) in Arabidopsis thaliana 28 Analisi elettrofisiologica dei protoplasti Micromanipolatore per esperimenti di elettrofisiologia con protoplasti. Nell'immagine si vede il capillare che sarà impiegato per il "patch clamp" sulle membrane cellulari e, in basso, il vetrino sul quale sono posti i protoplasti. L'apparato è posto sotto un microscopio invertito, dove gli obbiettivi sono sotto la piatto porta-vetrino, mentre in alto si vede il sistema condensatore che illumina il campo del microscopio.
29 Analisi elettrofisiologica dei protoplasti: il patch clamp pipe$a&per&il&patch&clamp& protoplasto&&&&&& La punta del capillare in vetro aderisce al protoplasto di una cellula di aleurone di orzo ed una piccola parte della membrana è succhiata all'interno del capillare-elettrodo. E' così valutata la differenza di potenziale elettrico tra la soluzione standard nel capillare e quella presente nel citoplasma. 30 Coltura dei protoplasti, formazione di cellule Dopo aver isolato i protoplasti, si procede alla stima del numero di protoplasti isolati, con l ausilio di una camera contaglobuli per cellule vegetali: protoplasti/ml= num. medioprotopl. x costante vetrino
31 Coltura dei protoplasti, formazione di cellule I protoplasti si raccolgono per centrifugazione e si aggiunge il mezzo di coltura, sino a portare la densità dei protoplasti attorno a 104-105 protoplasti ml-1 - Macro- e micro-elementi di Gamborg-B5 - Mannitolo 0,3 M (varia secondo specie e tessuto) - Saccarosio 0,05 M - CaCl2 1 gl-1 - Ormoni (generalmente, una citochinina ed una auxina) 32 Coltura dei protoplasti La vitalità dei protoplasti è controllata attraverso test colorimetrici o fluorimetrici con l Evans Blue o la fenosafranina (le cellule morte sono, rispettivamente, blu o fluorescenti), la fluoresceina diacetato (le cellule vive sono fluorescenti). Questi test sono semplici, ma riportano la sola funzionalità del plasmalemma. A B
33 Rigenerazione della parete cellulare Dopo circa 1 settimana, si riduce la pressione osmotica del mezzo riducendo la concentrazione del Mannitolo. La formazione della parete cellulare attorno ai protoplasti, stimolata dalla riduzione della pressione osmotica del mezzo di coltura, è indice di vitalità del materiale vegetale e di sviluppo delle colonie. La formazione della parete è controllata attraverso test fluorimetrici, come con il calcofluor white. Ultimo evento legato alla crescita delle cellule provenienti dai protoplasti è la divisione cellulare, indice che le cellule hanno superato ogni residuo stress ed hanno completato la fase di sintesi proteica e del DNA. 34 Formazione della parete cellulare e microcalli da protoplasti
35 36 Indici adottati per definire l efficienza di una coltura di protoplasti: Plating efficiency = n calli / n protoplasti piastrati Regeneration efficiency = n germogli / n prot. piastrati La conversione di protoplasti in cellule e di queste in organismi completi è strettamente dipendente dal genotipo, dal tessuto di provenienza dei protoplasti e dallo stato fisiologico di quest ultimo
37 L efficienza di una coltura di protoplasti è anche funzione della densità della popolazione di inoculo del mezzo di coltura Quando, per motivi scientifici, è necessario coltivare un unico protoplasto, allora bisogna far uso di un mezzo di coltura condizionato In quest ultimo caso si ricorre ad un mezzo semi-solido, impiegando Agasosio (tipo Sea-plaque) 38